唐铭袈，杨燕，王宇，刘忞之，王伟

杨梅糖基转移酶UGT71AN1的克隆与功能鉴定

唐铭袈，杨燕，王宇，刘忞之，王伟

100050 北京，中国医学科学院北京协和医学院药物研究所天然药物活性物质与功能国家重点实验室/国家卫生健康委员会天然药物生物合成重点实验室

从杨梅中分离鉴定糖基转移酶基因，进行其生物催化特性研究并应用于天然产物的糖基化修饰。

利用转录组测序分析从杨梅叶片中获得编码糖基转移酶的 Unigenes，再结合 RT-PCR 方法克隆获得该目标基因的 cDNA，然后构建表达载体并在大肠杆菌中进行异源表达，利用体外的酶促反应进行其生物催化活性研究。

从杨梅叶片中提取总 RNA，经转录组高通量测序和生物信息学分析获得编码糖基转移酶 UGT71AN1 基因；利用大肠杆菌进行异源表达并纯化获得融合蛋白，该酶能催化槲皮素、山奈酚、紫铆因、棕矢车菊素、原花青素和圣草酚等黄酮类化合物合成相应的葡萄糖苷；利用质谱和 NMR 对合成的糖苷进行结构鉴定，确定了槲皮素-3'-O-葡萄糖的糖苷键结构。

克隆获得一个具有催化黄酮类化合物形成葡萄糖苷的糖基转移酶基因，可利用酶促或全细胞生物催化进行黄酮类天然产物的糖基化结构修饰。

糖基转移酶类； 杨梅属； 生物催化； 黄酮糖苷

糖基化反应是天然产物生物合成过程中的一个重要修饰反应，结合羟基化、酰基化和甲基化反应形成植物次生代谢产物的多样性和复杂性。糖基化修饰能改善天然药物的成药性，尤其能增强其水溶性和稳定性。糖苷的形成是由糖基转移酶催化活化的核苷二磷酸单糖到不同的苷元，糖受体包括酚类、萜类、氰醇和生物碱在内所有类型的次生代谢产物[1-3]。虽然化学合成法可实现不同苷元受体的糖基化，但化学反应条件通常较为苛刻，需要保护和脱保护等多步反应，很难实现特定位置的糖基化修饰。随着高通量测序技术的发展，近年来植物转录组测序得到快速发展，极大地促进植物功能基因的克隆和功能鉴定。目前已有很多糖基转移酶得以功能鉴定，并建立了酶促反应和全细胞水平的生物催化体系并用于天然药物的结构修饰研究[4-7]。

糖基转移酶具有良好的区域或位置选择性（regio-selectivity）和立体选择性（stereo- selectivity）[8-9]，这一催化特性是实现特定位置的糖基化修饰的优势，但对含有多个可修饰位点的天然药物（尤其是含有多羟基的黄酮类化合物）实现不同羟基多样化的糖基化修饰而言也存在很大的不足，针对每个糖基化位点需要具有特定区域选择性的糖基转移酶。不仅如此，即使具有相同位置选择性的糖基转移酶，也呈现出不同的催化活性[10]。因此，为促进天然药物的糖基化修饰研究，需要分离鉴定功能多样的糖基转移酶基因。

杨梅（）具有很高的药用和食用价值，具有多种活性化合物如黄酮、酚类、有机酸、三萜等[11]，黄酮类化合物主要有槲皮素、杨梅素、山奈酚和花青素等[11]，已有的研究结果表明杨梅提取物的生物活性具有多种临床应用价值，如抗氧化、镇痛、抗癌、抗炎和抗高血脂[12]。杨梅中黄酮类化合物活性成分虽然具有多种药理活性[13-14]，但开发成药时受限于溶解度低，极大地阻碍了其制剂的开发与应用。黄酮类化合物在杨梅中大部分以糖苷形式存在，如杨梅素-3-O-鼠李糖苷（杨梅苷）、槲皮素-3-O-葡萄糖苷、槲皮素-3-O-芸香苷（芦丁）等[11]，而对于不同糖苷的化学提取纯化步骤繁琐，反应条件剧烈，产物回收率低。为利用生物催化技术进行杨梅中糖苷类化合物的合成，需要从杨梅中挖掘具有功能的糖基转移酶基因，但到目前为止还未有从杨梅中鉴定到有功能的糖基转移酶的研究报道。本研究利用转录组分析从杨梅中获得编码糖基转移酶的 Unigene，然后在大肠杆菌中进行异源表达并对其催化活性进行功能鉴定。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株 大肠杆菌DH10B 用于质粒载体的构建和制备；（DE3）用作融合蛋白的表达宿主。

1.1.2 仪器和试剂 Trizol 试剂和一步法逆转录酶 PCR 试剂盒均购自天根生化科技（北京）有限公司。

1.2 方法

1.2.1 杨梅叶片 RNA 的提取及 cDNA 合成 取–80 ℃冰箱冷藏的杨梅叶片经液氮速冻充分研磨后，按照 Trizol 试剂操作手册方法提取总 RNA。测定总 RNA 的浓度和纯度，260/280介于 1.8 ~ 2.2，说明提取的 RNA 无蛋白和 DNA 污染。委托上海美吉生物医药科技有限公司进行转录组测序和数据分析，参照一步法逆转录酶 PCR 试剂盒说明书合成 cDNA，用作糖基转移酶的候选基因克隆模板。

1.2.2 杨梅中糖基转移酶基因的克隆 根据杨梅转录组数据分析结果，选取候选糖基转移酶基因 Unigene 设计特异性引物用于候选糖基转移酶全长基因 cDNA 的克隆，引物设计如表 1 所示。用引物 UGT71AN1-5 进行 RNA 反转录合成 cDNA，RT-PCR 反应体系含有KAPA HIFI HotstartReady Mix 溶液 25 μl，引物 UGT71AN1-1 和UGT71AN1-4（10 μmol/L）各 2 μl，cDNA 模板1 μl，用 ddH2O 补足至 50 μl。反应程序为预变性 94 ℃ 5 min；变性 94 ℃ 50 s；退火 50 ℃ 1 min，延伸 72 ℃ 1 min 30 s，运行 30 个循环；延伸 72 ℃ 10 min。再以第一轮 PCR 产物为模板，使用引物UGT71AN1-2 和 UGT71AN1-3 进行第 2 轮 PCR扩增，然后把扩增的 DNA 片段亚克隆到大肠杆菌表达载体 pTWIN1B（在表达载体 pTWIN1 基础上进行多克隆位点的修饰）[10]，利用菌落 PCR 方法筛选正确的阳性克隆进行 DNA 测序验证。

1.2.3 杨梅中糖基转移酶基因的生物信息学分析 利用NCBI 分析工具 BLASTP 进行所克隆编码基因衍生的氨基酸序列一致性分析，下载相关的具有同源性和功能鉴定的糖基转移酶氨基酸序列，蛋白序列由 Clustal W 比对，使用 MEGA 6.0 软件构建 Neighbor-joining 系统进化树。系统进化分析的结果为后续进一步研究糖基转移酶的功能机制提供了理论基础。

1.2.4 糖基转移酶在大肠杆菌中的重组表达和纯化 将构建的重组质粒pTWIN1B-UGT71AN1 转化表达宿主菌Transetta（DE3）中，空载体 pTWIN1B 为对照。将含重组表达载体和空载体的Transetta（DE3）菌株于 37 ℃、220 r/min 摇床培养至600= 1.0，再按照 1% 的接种量将菌液接种至 100 ml 的 LB 培养基中（含 50 mg/L 的氨苄青霉素），培养至600= 0.6 后，加入终浓度为 0.55 mmol/L 的异丙基硫代半乳糖（IPTG），在 16 ℃、165 r/min的条件下诱导培养 16 h。随后以 8000 ×离心 10 min，收集菌体，并用 Buffer B1（20 mmol/L Na-HEPES，pH 8.5）漂洗两次，再次充分混悬菌体。将菌体混悬液使用高压均质机破碎 10 min，然后 12 500 ×离心 40 min，上清液即为粗酶液。

利用 IMPACTTM-TWIN 蛋白纯化系统对粗酶液进行纯化。将粗酶液上样于柱体积为15 ml 的几丁质柱进行亲和层析纯化，由于内含肽位于目的蛋白的 N-端，通过温度和 pH 值（pH 6 ~ 7）改变诱导内含肽的裂解，内含肽与目的蛋白之间的肽键被切割，目的蛋白得以分离释放。用 400 ml Buffer B1 清洗柱体，再用 3 倍柱体积的 Buffer B2（20 mmol/L Na-HEPES pH 6.5）冲洗柱体，温室放置 3 d。随后用超滤管脱盐浓缩，通过 SDS-PAGE 鉴定纯化蛋白。

1.2.5 糖基转移酶的活性筛选 利用纯化的融合蛋白 UGT71AN1 进行酶促反应，制备黄酮类糖苷的反应体系，包含 1 mmol/L 的底物、2 mmol/L UDP-Glc、1 mmol/L UGT71AN1 纯酶。酶促反应在 Tris-HCl（pH 7.2）缓冲液中进行，反应总体积为 200 μl。30 ℃、220 r/min 摇床振荡反应 12 h 后，加入 400 μl 的冰甲醇终止反应，充分混匀后离心取上清过 0.22 μm 滤膜，进而利用反相 HPLC 分析酶促反应产物，再用 HPLC分离制备少量产物进行 HR-ESI-MS 等谱学测定分析以对其结构进行鉴定。

表 1 本研究中涉及到的 PCR 引物

1.2.6 糖基转移酶大肠杆菌工程菌的全细胞生物催化 为建立全细胞生物催化合成糖苷的催化体系，需要在工程菌DE3/pTWIN1B-中继续转化含有磷酸葡萄糖变位酶（phosphoglucomutase，PGM）和葡萄糖-1-磷酸焦磷酸化酶（glucose-1-phosphate uridyltransferase，galU）基因的质粒 pSLB208-Pgm-T7-GalU[10]，这两个酶是糖基供体 UDP-葡萄糖合成关键酶。从转化平板上挑取单克隆，转接到 30 ml LB 培养基中，加入相应抗性的抗生素，37 ℃、220 r/min 振荡培养 6 h，600= 1.0；按照 1% 的接种量接种到100 ml 的 LB培养基中，37 ℃、220 r/min 培养2 ~ 3 h 后，600= 0.6 时加入 IPTG（200 mg/ml）65 μl，16 ℃ 165 r/min 诱导培养 16 h，离心收集菌体，漂洗2 次，加入到改良后的 M9 培养基（含 10% 的葡萄糖 pH 7.0）中，调节600= 6.0；分装菌液到反应容器中，向菌液中加入工作浓度为1 mmol/L 的槲皮素（母液浓度为 100 mmol/L，溶于 DMSO 中），每管 1 ml，每组为 3 个平行反应。30 ℃186 r/min 反应，分别于 0、2、4、6、10、12、24、36、48 h 时取样，测定600值，将反应体系冷冻干燥，加入 1 ml 的 80% 甲醇水溶液超声30 min，提取反应产物，12 000 r/min 离心 15 min，取上清液经 0.22 μm 的滤膜过滤，进行 HPLC 分析。产物以外标法定量，计算各时间点产物的收率。

2 结果

2.1 杨梅中糖基转移酶基因UGT71AN1 的克隆

本研究首次对杨梅叶片进行了转录组测序，并且基于杨梅叶片的转录组分析结果，共发现 11 个功能注释为糖基转移酶的 Unigenes，其中 Unigene（c35900_g1_i1）被注释为黄酮糖基转移酶，然后采用 RT-PCR 方法直接克隆具有完整 ORF 的 cDNA，长度为 1437 bp，编码 478 个氨基酸残基，已在 GenBank 注册（MK722191）并由碳水化合物活性酶数据库（CAZy）（http://www.cazy.org/）对其功能注释分类为 UGT71AN1 亚家族。利用 NCBI 分析工具 BLASTP 进行分析，该基因编码的氨基酸序列与 UGT71 家族的糖基转移酶具有较高的一致性（55.18% ~ 68.5%）；UGT71AN1 C-端具有典型的糖基转移酶家族保守的结构域（plant secondary product glycosyltransferases，PSPG），PSPG 结构域是糖基供体与目的蛋白发生作用的主要作用区域[15]，图 1 是针对下文系统进化分析中 32 个糖基转移酶保守的 PSPG 结构域氨基酸残基的统计分析。

2.2 杨梅中糖基转移酶 UGT71AN1 的生物信息学分析

糖基转移酶是一个多成员的基因家族，根据其氨基酸序列的同源性、催化底物性质、反应机制和三维结构，糖基转移酶被分为 106 个家族（CAZY），从CAZY 给出的信息得知 UGT71 家族与 GT8 家族具有较近的亲缘关系，而 GT8 家族的底物谱包括生物激素类、黄酮类、萜类等，推测 UGT71 家族的底物谱也可能包含这些底物。UGT71AN1 与来自其他植物 UGTs 的系统进化树如图 2 所示，UGT71AN1 基因与 UGT71 家族中的糖基转移酶OAP09182（UGT71C1）、NP_001280899（UGT71K1）、D3UAG2（UGT71K2）等相似度较高，在系统进化树中聚为一大类，归属为能催化黄酮多位点的糖基转移酶，如NP_001280899（UGT71K1）和 D3UAG2（UGT71K2）能分别催化根皮素-2'-O-羟基和黄酮-4'-O-羟基的糖基化[16-17]，表明 UGT71 家族参与多种类型的次生代谢产物的糖苷化反应，并且催化底物广泛。UGT71AN1 作为 UGT71 家族的单独分支，也可能参与杨梅中多种活性成分的糖基化反应。

图 1 32 个糖基转移酶 C-端保守 PSPG 结构域

Figure 1 Weblogo of conserved PSPG motifs identified in the 32 glucosyltransferases

Figure 2 The phylogenetic tree analysis of UGT71AN1 and other plant UGT proteins by Neighbor-Joining method on MEGA 6.0 [GenBank Accession numbers of the GTs:(AFI71901, AFI71902),(OAP13716, NP_193283, NP_188793, OAP09182),(PIN26436),(ACS15351),(NP_001105886),(XP_020222524),(AHJ80981),(XP_003543752),(EXB94563),(NP_001312241),(ABL85474),(Q767C8),(B2NID7),(AHL68667),(C3W7B0),(I1L3T1),(A0A0A1HA03), Fragaria x ananassa (Q66PF4),(AAS55083),(AIF79773),(AJT58578),(NP_001280899, RXH90237),(D3UAG2),(AYR16626),(D3UAG1),(ACB88210),(MK722191)]

2.3 糖基转移酶 UGT71AN1 的异源表达和纯化

糖基转移酶 UGT71AN1 为非分泌蛋白，利用大肠杆菌进行异源融合表达，经高压破碎菌体后，细胞内的蛋白释放出来，SDS-PAGE 分析结果如图 3 所示，与对照相比，UGT71AN1 重组菌体破碎上清液在 70 ~ 100 kD 处有明显的增强表达的蛋白条带，说明杨梅糖基转移酶基因在Transetta（DE3）表达宿主中可溶性的融合表达。经过亲和层析纯化，大小约为 20 kD 的内含肽被切割掉，洗脱纯化后的 UGT71AN1 蛋白条带大小与预期相符，约 55 kD 左右，纯度达到 90% 以上。经超滤脱盐，获得 5 ml 纯酶，质量浓度为 0.4 mg/ml。将纯化后的酶与 40% 甘油以1:1 的比例保存于–80 ℃冰箱备用。

Figure 3 SDS-PAGE electrophoresis analysis of expressed UGT71AN1

2.4 糖基转移酶的活性筛选

不同糖基转移酶识别的受体各有不同，N-端结构域是主要的识别部位[18]，根据碳水化合物活性酶数据库的功能注释选取以黄酮类化合物为受体和 UDP-葡萄糖为供体，在糖基转移酶的催化下，酶促催化合成槲皮素、山奈酚、(S)-圣草酚、异甘草素、紫铆因和棕矢车菊素形成相应的糖苷类化合物（图 4A）。通过 HPLC 检测反应产物，利用反应底物和生成的糖苷产物的色谱积分初步计算相对活性，对棕矢车菊素具有最好的催化活性，其次是山奈酚、槲皮素、异甘草素、紫铆因和 (S)-圣草酚（图 4B）；再结合阳离子扫描质谱图和标准品对比确认糖苷产物。

对槲皮素糖苷进行了结构鉴定：首先利用 HPLC 进行分离纯化，如图 5A 所示，UGT71AN1 反应组中底物槲皮素保留时间为 20.23 min，在保留时间为 11.88 min处有明显单一产物峰，质谱 HR-ESI-MS 阳离子模式扫描结果 m/z 465.39 [M+H]+，487.47 [M+Na]+（图 5B）；质谱分析结果进一步证实了 UGT71AN1 催化槲皮素形成了槲皮素-3'- O-葡萄糖苷（分子式为 C21H20O12），并经1H-NMR和13C-NMR 手段鉴定结构。

1H-NMR（500 MHz，DMSO-d）δ = 7.62（m，1H，H-2'），7.61（m，1H，H-6'），6.88（m，1H，H-5'），6.45（d，= 2.0 Hz，1H，H-8），6.24（d，= 2.0 Hz，1H，H-6），5.50（d，= 7.2 Hz，1H，H-1''），3.63（m，2H，H-5''，H-6a''），3.47-3.26（m，3H，H-2"，H-3"，H-4''），3.12（m，1H，H-6b"）。

13C-NMR（125 MHz，DMSO-d）δ = 157.3（C-2），134.2（C-3），178.4（C-4），157.1（C-5），99.6（C-6），165.1（C-7），93.2（C-8），162.2（C-9），104.9（C-10），122.6（C-1'），116.2（C-2'），145.8（C-3'），149.4（C-4'），117.1（C-5'），122.1（C-6'），101.7（C-1''），73.3（C-2''），75.8（C-3''），70.9（C-4''），77.4（C-5''），61.9（C-6''）。

2.5 槲皮素-3'-O-葡萄糖苷的全细胞催化合成

以槲皮素为受体底物，考察在 M9 培养基（含 10% 葡萄糖）中工程菌催化其合成槲皮素-3'- O-葡萄糖苷的生物催化动力学，如图 6 所示。调整工程菌的初始菌密度600值为 6.0，于 0 h 添加 1 mmol/L 槲皮素，产物在 12 h 内迅速增加，而后12 ~ 72 h 基本保持平衡，工程菌在0 ~ 10 h 依然保持生长活性，在 48 h 时达到生长顶峰，因长时间培养过程中营养的耗尽，48 h 后呈现下降趋势。

3 讨论

天然产物具有抗病毒、抗菌、抗氧化、抗肿瘤、降血糖、降血压以及增强免疫等生物活性。但也存在生物活性不佳、溶解度低、稳定性差或不良反应等因素使得天然产物的新药研发难度增加并限制了其临床应用。糖基化修饰能改变这些化学分子的活性、水溶性、稳定性，另外还能降低或消除有毒物质的毒性[1, 4, 19]。糖基转移酶是实现糖基化修饰的一类重要催化反应，目前不仅已有功能多样的糖基转移酶被克隆和功能鉴定，还有酶促水平和全细胞的生物催化技术得以迅速发展和广泛应用[6-7, 10, 19]。尽管如此，生物催化进行糖基化修饰还有很多制约因素需要深入研究，如活化的糖基供体供给、糖基转移酶的催化活性及立体或位置选择性问题。

为解决生物催化糖基化修饰过程中区域选择性问题，提高催化底物活性可采用蛋白质工程对糖基转移酶进行定向进化工程改造[6, 20-21]，但是随着基因组、转录组等基因测序技术的发展，快速分离获得具有功能多样的糖基转移酶依然是直接发现目标糖基转移酶最主要的策略，不仅如此，糖基转移酶的蛋白质工程也是基于功能鉴定的目标基因基础之上。因此，本研究依据转录组测序分析结果，从杨梅中分离鉴定了第一个糖基转移酶 UGT71AN1（GenBank：MK722191），经过在大肠杆菌中异源表达和纯化获得目标蛋白，然后在体外建立生物酶促催化反应进行功能鉴定，已通过 HPLC 和 HR-ESI-MS 分析证实了其能催化多个黄酮类化合物的糖基化，并确定了槲皮素-3'-O-葡萄糖的糖苷键结构。系统进化分析结果表明 UGT71AN1 与 NP_001280899（UGT71K1）和 D3UAG2（UGT71K2）具有较高的氨基酸序列一致性并聚类在一个亚家族，位置选择性与进化聚类的结果一致[17-18]。

Figure 4 Enzymatic reaction of UGT71AN1 and relative enzymatic activities (A: Diagrammatic sketch of catalytic reaction of glycosylation reaction; B: Biotransformation of flavones into respective glucosides using the enzyme UGT71AN1)

Figure 5 Glucosylation of quercetin through enzymatic reaction and the characterization of corresponding glucoside product [A: HPLC analysis of reaction products (1: The reaction with quercetin, UDP-glucose and the purified UGT71AN1; 2: The negative reaction without the purified UGT71AN1); B: HR-ESI-MS analysis of glucoside]

图 6 槲皮素-3'-O-葡萄糖苷全细胞生物催化动力学

Figure 6 Time course for the production of quercetin-3'-O-glucoside in engineered strain

通过对催化底物的结构对比分析，尽管山奈酚和棕矢车菊素没有 3'-O-羟基，查尔酮类异甘草素对应的芳环上也没有 3-O-羟基，但是 UGT71AN1 对这几个黄酮类化合物依然都有很好的催化活性，说明该酶具有较广泛的羟基化位点选择性，这些糖苷的结构还需要进一步进行糖苷化产物的制备和结构鉴定。为探索其全细胞催化的可行性，我们把含有催化 UDP-葡萄糖合成的 2 个关键酶与 UGT71AN1 进行共诱导表达，通过外源添加槲皮素实现了槲皮素-3'-O-葡萄糖的全细胞生物催化合成。上述研究结果为从杨梅中分离鉴定更多的糖基转移酶和把这些糖基转移酶应用于其他黄酮类或其他天然产物的结构修饰提供了实践借鉴。

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Identification and characterization of glucosyltransferaseUGT71AN1 from

TANG Ming-jia, YANG Yan, WANG Yu, LIU Min-zhi, WANG Wei

Author Affiliation: State Key Laboratory of Bioactive Substance and Function of Natural Medicines, Key Laboratory of Biosynthesis of Natural Products of National Health Commission of the People's Republic of China, Institute of Materia Medica, Peking Union Medical College & Chinese Academy of Medical Sciences, Beijing 100050, China

To identify and characterize a novel glucosyltransferase from, and further test its biocatalytic regio-specificity and apply it to conduct the glycosylation modification of natural products.

Basedon the results of transcriptome analysis of, the candidate Unigene was firstly selected. A cDNA clone encoding a uridine diphosphate (UDP) glucotransferase was amplified by RT-PCR and then inserted into an expression vector pTWIN1b. It was heterologously expressed inTransetta (DE3), and its enzymatic activities was examinedby enzymatic bioconversion and whole-cell biocatalysis.

A novel gene encoding UDP-glucotransferase was cloned by RT-PCR usingcDNAs as templates according to the selected candidate Unigene sequence, based on the results of transcriptome analysis. And then it was functionally named asby the Carbohydrate-Active Enzymes Database based on the identity to the other glycosyltransferases. It was successfully expressed inTransetta (DE3) and purified. Its enzymatic activities were employed and six flavonoids such as quercetin, kaempferol, (S)-eriodictyol, isoliquiritigenin, butein, and jaceosidin were observed to be glucosylated. Their corresponding glucosides were identified by HR-ESI-MS. Among them, the glucosidic bond quercetin-3'-O-glucoside was verified by1H- and13C-NMR spectra.

The multi-function UDP-glucosyltransferase UGT71AN1 catalyzing the glucosylation of flavonoids was characterized fromleaves, and it can be further used to catalyze the glycosylation of the other flavonoids through enzymatic or whole-cell biocatalysis.

Glycosyltransferases;; Biocatalysis; Flavonoid glycosides

WANG Wei, Email: wwang@imm.ac.cn

10.3969/j.issn.1673-713X.2019.05.001

中国医学科学院医学与健康科技创新工程项目（2016-I2M- 3-012、2017-I2M-1-011）；“重大新药创制”国家科技重大专项（2018ZX 09711001-006）

王伟，Email：wwang@imm.ac.cn

2019-04-23