何芳，伍佰鑫，周望平，浣成，罗阳

（湖南省畜牧兽医研究所，长沙 410131）

奶牛乳房炎是目前奶牛群中发病率最高、花费最多、淘汰率最高、损失最严重的疾病，严重制约着奶牛业的发展。据统计我国奶牛场乳房炎疾病的发病率为46%～70%，造成的经济损失可达30亿美元，且每年用于乳房炎防控经费支出约2080万美元，严重影响着我国奶牛养殖业的发展[1]。李树梅等[2]在河北地区720份乳样中检测出182份隐性乳房炎，发病率为25.3%，其中主要致病菌为金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、无乳链球菌和溶血葡萄球菌。杨兴斌[3]利用LMT法对甘肃地区6家奶牛场共240份乳样进行检测，发现有118份为隐性乳房炎，平均检出率49.17%，且检出率与其胎次呈正相关。目前，奶牛乳房炎主要使用抗生素以乳头灌注的方法给药进行治疗，长期使用抗生素导致了奶牛乳腺泌乳能力下降，还造成了严重的耐药性和药物残留，严重影响着人们的健康[4]。有试验表明，奶牛乳房炎病原菌对青霉素等常用抗菌药产生了不同程度的耐药性，耐药率最高(青霉素)达61.64%[5]。

中草药富含多种抑菌或者杀菌的活性物质，对病原菌有直接或者间接的杀灭作用，具有无残留、无耐药性等多种优点，广泛应用于畜禽疾病防治[6]。研究表明中药对防治奶牛乳房炎有着残留低、刺激性小、效果好的优点。张宝静等[7]认为中草药在治疗乳腺炎时疗效高于抗生素，而抗生素组疗效较低的原因，可能与长期使用抗生素而产生抗药性有关。但是目前，中草药制剂稳定性较差，方剂种类较少、配方没有明确标准，操作较麻烦。本研究旨在克服现有技术的不足，研制一种中药喷雾剂，为中草药在防治奶牛乳房炎方面的研究提供参考。

1 材料

1.1 药品

半枝莲、蒲公英、木芙蓉、苏木、黄柏、青皮，八角枫、木别子、熟地、皂刺、木贝母、赤芍、野菊花、夏枯草、暮草、八角莲、两面针、金银花藤、青皮树枝叶、白花、肿节风连钱草、地丁草、八角枫叶、号桐杆等25种中草药，均购置于湖南中药材市场。

1.2 主要培养基

血琼脂培养基，普通琼脂培养基，麦康凯琼脂培养基，蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏（均为分析纯），购自杭州天和微生物试剂有限公司。

1.3 奶牛乳房炎病原菌

金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、停乳链球菌、乳房链球菌，为湖南省畜牧兽医研究所分离、保存的菌株。

1.4 试验动物

试验动物均来自湖南省畜牧兽医研究所奶牛原种场。

2 方法

2.1 防治奶牛乳房炎中草药的体外筛选方法

2.1.1 中草药的提取

将中草药用75%的医用酒精浸泡3～4d，再用旋转蒸发仪浓缩，回收酒精。重复3次，将三次得到的药液混合。将浸泡后的药物残渣再进行水煎提取3次。最后将醇提液和水煎药物合并用旋转蒸发仪浓缩至100mL（1g生药/mL），过滤，灭菌，放置冰箱备用。

2.1.2 菌液的制备

取生长于普通营养琼脂培养基（链球菌为血液培养基）上的试验菌，用接种环蘸取少量菌落，接种于4～5mL的普通肉汤中，35℃孵育2～6h。增菌后的对数生长期菌液用生理盐水或肉汤校正浓度至0.5麦氏比浊标准，使其含菌1～2×108CFU/mL。

2.1.3 中草药体外抑菌作用的测定

采用药物纸片琼脂扩散法。将浸有中草药的纸片（直径为6mm）贴在平皿上，37℃培养箱中培养18h（链球菌培养24h）后测定抑菌圈直径。并以0.1g/mL的氨苄西林钠作为对照。

2.1.4 最低抑菌浓度（MIC）和最低杀菌浓度（MBC）的测定

对体外抑菌试验效果明显的几种中草药进行最低抑菌浓度和最低杀菌浓度的测定，采用管碟法：取9支试管，每支试管加液体培养基4.0mL，灭菌后备用。将灭菌的药物4.0mL加入第一支试管中混匀，依次将药物二倍稀释，共稀释成8个不同浓度后，第1～8管药物浓度分别为20、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7g/mL。第9支试管为液体培养基阴性对照。第1～8管每支试管再加入0.02mL菌悬液，培养24h。以肉眼观察不显示浊度、药物浓度最小的一管作为MIC；分别取不显示浊度试管中的肉汤0.05mL接种培养平板上，再培养24h，以无菌落或菌落生长数≤10的培养板所对应的最小药物浓度为MBC。

2.2 防治奶牛乳房炎复方中草药制剂的制备

2.2.1 中药组方

在单味药抗菌活性的基础上，根据奶牛乳房炎的发病机理、中兽医学理论和药剂学理论，以传统经典组方瓜蒌散为基础，进行加减，选用对四种病原菌表现出较好抑菌效果的中草药组成复方。

2.2.2 复方中草药喷雾剂的制备

中草药复方经醇提和水煮合并以后，加热浓缩成浸膏。再缓慢加到配制好的复合溶媒（蒸馏水:无水乙醇:助溶剂）中，直至达到饱和为止。用3号耐酸过滤器滤去未溶解的药物残渣。最后加入2%的促渗剂和0.1%的高锰酸钾。

2.3 复方中草药喷雾剂对奶牛临床型乳房炎的治疗

表125种中草药对四种病原菌的平均抑菌直径 单位：mm

2.3.1 试验方法

奶牛乳区临床表现出红、肿、热、痛，奶汁稀薄，或带有絮状物、脓块、血色的诊断为临床型乳房炎患乳区。从2017年9～11月两个月的时间内，对在湖南省畜牧兽医研究所奶牛原种场发现的患牛，一经确诊后马上用试验药物进行治疗，每天上下午各一次喷药物于患乳房基部，连续用药，未治愈的继续给药。共有18头奶牛18个患乳区进入试验。

2.3.2 判断标准

痊愈判定标准：食欲正常，乳区的红、肿、热、痛消失，肉眼观察乳汁正常，产奶量恢复至正常水平。无效判定标准：用药5d后，乳区的红、肿、热、痛消失不明显，乳汁仍异常，产奶量没有恢复。

3 结果与分析

3.1 防治奶牛乳房炎中草药筛选结果

3.1.125种中草药体外抑菌试验结果

从表1中可以看出半枝莲、赤芍、苏木、黄柏、木芙蓉、熟地、蒲公英7种中草药对四种病原菌都表现出了较好的抑菌效果，而青皮、八角枫叶、八角莲、两面针、地丁草、八角枫根、号桐杆对四种病原菌体外抑菌效果不明显。体外抑菌试验是药物筛选的初步条件，因此可将半枝莲、赤芍、苏木、黄柏、木芙蓉、熟地、蒲公英作为防治奶牛乳房炎制剂研制开发的主药。

3.1.2 最低抑菌浓度和最低杀菌浓度测定结果

表27种中草药对4种致病菌的MIC和MBC 单位：g/mL

特别观察上述细菌抑菌圈实验筛选出的7种药的MIC与MBC，结果如表2所示。

3.2 中草药复方喷雾剂治疗奶牛临床型乳房炎的临床试验结果

由表3显示结果可以看出中草药复方喷雾剂对奶牛临床型治疗乳房炎的治愈率达到88.9%，有效率为100%，表现出了较好的治疗效果。在试验过程中还发现，与抗生素联合用药可大大缩短治疗疗程。同时对于抗生素长期治疗无效的顽固性乳房炎，改用试验用的中草药复方喷雾剂和抗生素联合用药治疗，表现出了良好的治疗效果。

表3 中草药复方喷雾剂治疗奶牛临床型乳房炎的效果

4 讨论

奶牛乳房炎是奶牛的一种常见疾病，每年都会给全世界奶业及养殖业造成巨大的损失，包括产奶量降低、乳品质下降以及生产成本的提高[8]。造成奶牛乳房炎的因素很多，其中，病原微生物感染是其主要病因。多种病原菌均可以引起奶牛乳房炎，其中以链球菌、金黄色葡萄球菌、大肠杆菌（E.coli）为主，大肠杆菌引起的乳房炎多见于高产奶牛及产后泌乳高峰期奶牛[9,10]。

我国一般使用抗生素以乳头灌注的方法治疗奶牛乳房炎，但长期大量使用抗生素，不仅使奶牛的乳腺泌乳能力下降，使病原菌产生耐药性，增加了治疗的难度，同时造成了严重药物残留，影响牛奶的品质和人们的健康[11]。药物残留、环境污染等问题已引起全社会高度关注，研究可替代抗生素类的新型药物已成为新课题。中草药富含多种抑菌或者杀菌的活性物质，对病原菌有直接或者间接的杀灭作用，兼有药物和营养双重功效，具有低毒、低残留，不易产生耐药性、绿色环保等优点，目前已成为国内外学者研究的焦点。专家学者在应用中草药防治奶牛乳房炎方面进行了大量研究，取得了一系列成果。研究发现，单味中草药在防治奶牛乳房炎的过程中，常存在用量大、效果不明显、利用率低等缺点[12]。而复方中草药制剂可以提高治疗效果，减少单味中草药的毒性，弥补单味中草药防治奶牛乳房炎的不足。复方中草药制剂在机体内不仅可以直接抑制或者杀灭导致乳房炎的病原菌，而且可以提高机体的免疫力，调节机体的新陈代谢，促进营养物质的消化与吸收。多项研究证实了中草药及其复方制剂在防治奶牛乳房炎方面具有很好的效果。叶文初等[13]报道了苦豆草提取物对奶牛乳房炎致病菌具有很好的体外抑菌效果。郝景锋等[14]研究表明蒲公英、鱼腥草、益母草、红花、金银花等5味中药对奶牛隐性乳房炎3种病原菌的综合抑制效果较好。路孝兵[12]报道了中药蒲和饮透皮剂对金黄色葡萄球菌和大肠杆菌引起的奶牛乳房炎具有很好的治疗效果。曲家华等[15]报道，蒲公英、金银花、连翘等组方的中草药粉剂“乳康健”对奶牛隐性乳房炎有良好的治疗作用，日粮中添加500g/（头·d）饲喂7d，乳区阳性率由29.17%下降为8.33%。贾丽萍等[16]比较了灌服蒲公英散( 蒲公英、全瓜蒌、银花等组方)与乳头孔注入氯唑西林钠治疗乳房炎的疗效，结果显示3个疗程（1个疗程5d）的有效率和治愈率蒲公英散比氯唑西林钠分别高了16.1和20.4个百分点（P＜0.05），复发率低了9.2个百分点（P＜0.05）。吕平等[17]研究发现，苦丁茶、蒲公英、丁香的提取物和溶菌酶组合的复合物对临床型奶牛乳房炎病原菌金黄色葡萄球菌、大肠埃希氏菌、无乳链球菌有明显体外抑制作用。

本临床试验结果表明：以半枝莲、赤芍、苏木、黄柏、木芙蓉、熟地、蒲公英等数味药制备成的中草药喷雾剂对临床型奶牛乳房炎的治愈率达到88.9%，有效率为100%，表现出了较好的治疗效果。在试验过程中还发现，与抗生素联合用药可大大缩短治疗疗程。同时对于抗生素长期治疗无效的顽固性乳房炎，改用试验用的中草药复方喷雾剂和抗生素联合用药治疗，表现出了良好的治疗效果。