蔡霈 文晓柯 欧阳波 肖作奇

[摘要] 目的 研究地肤子总黄酮（FFK）对二硝基氯苯（DNBC）致大鼠变态反应性接触性皮炎（ACD）的抗炎作用。方法 SPF级SD大鼠40只，雌雄各半，按随机数字表法分为五组，每组8只，即空白对照组、ACD模型组、阳性药对照组（醋酸泼尼松龙2.5 mg/kg）、FFK低剂量组（75 mg/kg）、FFK高劑量组（150 mg/kg）;以DNBC建立大鼠ACD模型后，予以FFK灌胃给药，连续10 d。观察皮肤变态性反应和肿胀度，同时测定血清中白细胞介素-6（IL-6）、白细胞介素-10（IL-10）和γ干扰素（IFN-γ）表达水平，并通过免疫组化检测耳组织中核因子κB p65（NF-κB p65）表达水平。 结果 与空白对照组比较，ACD模型组大鼠皮肤肿胀度明显增高，血清中IL-6、IFN-γ含量与耳组织中NF-κB p65蛋白表达明显增高，而血清中IL-10含量明显降低（P < 0.01）;与ACD模型组比较，FFK低剂量组与FFK高剂量组大鼠的耳肿胀度、血清中IL-6、IFN-γ含量、耳组织中NF-κB p65蛋白表达水平显著降低（P < 0.01），而血清中IL-10含量显著升高（P < 0.01）。 结论 FFK对于DNBC致大鼠ACD具有抗炎作用，其机制可能是通过抑制NF-κB p65蛋白发挥作用。

[关键词] 地肤子总黄酮;炎症;接触性皮炎;核转录因子-κB p65

[中图分类号] R758.22          [文献标识码] A          [文章编号] 1673-7210（2019）07（b）-0017-04

Anti-inflammatory effect of the total flavonoids of Fructus Kochiae in DNBC-induced allergic contact dermatitis rats

CAI Pei   WEN Xiaoke   OUYANG Bo   XIAO Zuoqi

Department of Pharmaceutical Research， Hu′nan Provincial Maternal and Child Health Care Hospital， Hu′nan Province， Changsha   410008， China

[Abstract] Objective To investigate the anti-inflammatory effect of the total flavonoids of Fructus Kochiae （FFK） on DNBC-induced allergic contact dermatitis （ACD） rats. Methods According to random number table method， 40 half male and half female SPF grade SD rats were randomly divided into 5 groups， with 8 rats in each group， including blank control group， ACD model group， positive control group （Splash Methylprednisolone 2.5 mg/kg）， FFK low-dose group （75 mg/kg）， FFK high-dose group （150 mg/kg）. After ACD model were established by treatment of DNCB on right ear for 10 days， rats were treated with FFK in 10 d and the allergic reaction and swelling degree of ears were observed， the content of IL-6， IL-10 and IFN-γ in serum and the level of NF-κB p65 in ears were determined. Results Compared with the blank control group， the swelling of ears in ACD model group was significantly increased， the content of IL-6， IFN-γ in serum and the level of NF-κB p65 in ears were up-regulated， while the content of IL-10 was down-regulated in serum （P < 0.01）. Compared with the ACD model group， the ears swelling degree of rats in FFK low-dose group and FFK high-dose group was significantly decreased， the content of IL-6， IFN-γ in serum and the level of NF-κB p65 in ears were significantly down-regulated， while the content of IL-10 in serum was significantly up-regulated （P < 0.01）. Conclusion FFK has anti-inflammatory effect on DNBC-induced ADC rats and its mechanism involved in down-regulate the NF-κB p65.

[Key words] Total flavonoids of Fructus Kochiae; Inflammation; Allergic contact dermatitis; NF-κB p65

地肤子为黎科植物地肤Kochia Scoparia （L.） Schrad.的干燥成熟果實，其性寒、味甘苦，具有清热利湿、祛风止痒等功效，常用于小便涩痛、阴痒带下、皮肤瘙痒、湿疹等病症[1]。现代医学研究证明，地肤子具有抗氧化、抗过敏、抗病原微生物等作用[3-7]。地肤子主要含有黄酮及皂苷类成分，皂苷类成分近年来研究较多，而对于黄酮类的成分却鲜见报道。目前，地肤子黄酮类成分的药理作用研究仅限于其体外抗氧化活性[8-9]。本研究通过建立二硝基氯苯（DNBC）诱导的大鼠变态反应性接触性皮炎（ACD）评价地肤子总黄酮（total flavonoids of Fructus Kochiae，FFK）对其治疗作用，观察FFK对于大鼠ACD的治疗作用并对其作用机制进行初步探讨。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物  SPF级SD大鼠，雌雄各半，体重50～60 g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，许可证号：SCXK（湘）2011-0003。动物合格证号为：NO.4300470013754。饲养于湖南师范大学医学院实验动物中心，自由进食及饮水，实验室温度（22±2）℃，湿度60%～80%，人工光照约12 h∶12 h明暗周期。

1.1.2 药品与试剂  醋酸泼尼松龙片（规格1片∶5 mg）购于天方药业有限公司，生产批号：180211135;2，4-硝基氯苯（2，4-DNCB），购于山东西亚化学股份有限公司，生产批号：W5784;IL-6（货号：F3066-A）、白细胞介素-10（IL-10，货号：F3071-A）、TNF-α（货号：F3056-A）均购于上海科兴生物科技有限公司;核转录因子-κB p65（NF-κB p65）大鼠抗体（货号：ARG65677）购于上海雅吉生物科技有限公司;芦丁购自上海诗丹德生物技术有限公司，生产批号：153-18-4，纯度为99.8%;乙醇、丙酮均为国产分析纯，购自国药集团;地肤子购于湖南衡东县中药饮片厂，生产批号：20170428，经湖南省中医院药学部王竹鑫主任药师鉴定为黎科植物地肤的干燥成熟果实，各项规定均符合2015年版《中华人民共和国药典》[1]。

1.1.3 仪器设备  Leica RM2235型莱卡石蜡切片机（德国莱卡）;SEN-CO W201恒温水浴锅（上海申生科技有限公司）;5424R高速离心机（Eppendorf）;DP72奥林巴斯显微成像系统;RT-6100酶标分析仪（深圳雷杜生命科学股份有限公司）;XS205型电子天平（德国梅特勒-托利多）。

1.2 方法

1.2.1 地肤子总黄酮的制备  地肤子粉碎后经80%乙醇提取，经大孔树脂富集减压干燥所得棕色粉末即为FFK，以芦丁为标准品，应用NaNO2-Al（NO3）3-NaOH反应体系测得其含量为85.64%总黄酮有效部位。

1.2.2 DNCB诱导的大鼠ACD模型建立  将丙酮与橄榄油按4∶1的体积比混合均匀，加入不同质量的DNCB使其溶解，最后配制成1%和7%的DNCB溶液。首先将7% DNCB溶液涂抹于大鼠腹部除毛处进行腹部致敏，之后改用1% DNCB溶液增强致敏。5 d后将1% DNCB溶液涂抹于大鼠右耳，连续3 d，即建立DNCB诱导的ACD大鼠模型[10]。

1.2.3 地肤子总黄酮对ACD大鼠的抗炎作用  取8只正常大鼠为空白对照组，取40只ACD大鼠按随机数字表法分为ACD模型组、阳性药对照组（醋酸泼尼松龙2.5 mg/kg）、FFK低剂量组（75 mg/kg）、FFK高剂量组（150 mg/kg），每组8只;各组灌胃给药10 d后（空白对照组与DNCB模型组予以等体积1% CMC-Na，其余各组药物均以1% CMC-Na混悬），以8 mm穿孔器右耳组织，并用千分尺测量厚度评价鼠耳肿胀程度。同时各组取4只大鼠耳组织石蜡包埋切片然后进行HE染色分析。

1.2.4 酶联免疫吸附试验（ELISA）测定大鼠血液中的炎症因子  腹主动脉采集上述给药10 d后的大鼠血液样本2 mL，室温静置30 min后，于4℃，3000 r/min离心10 min，收集血清样本于-80℃冰箱保存。参照试剂盒说明书用ELISA法检测血清中白细胞介素-6（IL-6）、IL-10和γ干扰素（IFN-γ）含量。

1.2.5 免疫组化评价  检测大鼠耳组织中的NF-κB p65的蛋白表达水平。取“1.2.2”石蜡切片进行免疫组化分析。即经脱蜡固定后，加入NF-κB p65一抗（1∶500）、二抗孵育，之后染色封片，应用Image-Pro Plus 6.0对结果进行分析，数据以各组积分光密度均值与空白对照组比值表示。

1.3 统计学方法

采用SPSS 17.0统计学软件进行数据分析，计量资料用均数±标准差（x±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA）和Dunnett′s t检验进行组间比较。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 FFK对ACD大鼠耳肿胀度的影响

经10 d的药物治疗后，与空白对照组比较，ACD模型组大鼠右耳仍呈明显的红肿状态，而阳性药对照组大鼠经泼尼松治疗后基本恢复正常，FFK低、高剂量组均有效改善了大鼠右耳的红肿状态。与空白对照组比较，ACD模型组大鼠耳厚和耳重明显增加（P < 0.01）;与ACD模型组比较，FFK高、低剂量组大鼠耳厚和耳重显著降低（P < 0.01）。见表1。

2.2 大鼠耳组织病理学观察

与空白对照组比较，经DNCB诱导的ACD模型大鼠耳组织切片HE染色显示其单核细胞出现明显浸润，表皮细胞呈角质化，耳组织可见明显肿胀，而FFK高、低剂量组与阳性药对照组可见其耳组织的红肿与炎症状态有明显改善。见图1。

2.3 FFK对ACD大鼠血清中炎症因子IL-6、IL-10与IFN-γ的影响

免疫共沉淀结果显示，与空白对照组比较，ACD模型组大鼠血清中IL-6、IFN-γ的含量显著升高（P < 0.01），而IL-10的含量明显降低（P < 0.01），提示ACD模型大鼠发生了严重的炎性反应。而经过FFK治疗后的ACD模型大鼠其血清中IL-6与IFN-γ含量显著降低（P < 0.01），IL-10显著升高（P < 0.01），提示FFK能够有效治疗ACD模型大鼠的炎性反应。见图2。

2.4 FFK对ACD大鼠NF-κB p65表达的影响

免疫组化分析结果显示，与空白对照组比较，ACD模型组大鼠耳组织NF-κB p65蛋白表达显著上调，差异有高度统计学意义（P < 0.01）;与ACD模型组比较，FFK低、高剂量组能够下调由DNCB诱导的大鼠耳组织NF-κB p65表达，差異有高度统计学意义（P < 0.01）。见图3～4。

3 讨论

炎症是多种疾病的基本病理过程，人类的许多常见疾病如各种病原体感染（肝炎、结核病等）、自身免疫性疾病、皮炎湿疹等都属于炎症范畴。炎症的发生过程不仅与炎症相关酶、炎症介质、细胞因子有关，还涉及核因子-κB、一氧化氮、自由基的参与。NF-κB是细胞炎症以及多种自身免疫性疾病调节的关键蛋白[11-13]。它在应激条件下能够刺激辅助性T细胞产生IL-2、IL-6、IL-10以及IFN-γ等炎症因子[14-17]，如IFN-γ能够活化巨噬细胞，继而释放多种炎症介质[18-19]。DNCB能够与上皮蛋白可溶性部分共价结合成为完全抗原，已广泛应用于建立ACD模型，其机制为诱导皮肤组织的T细胞浸润，包括Th1诱导的迟发型超敏反应和Th2诱导的过敏反应，而这一反应激活了下游的IL-6、IFN-γ等炎症因子[20-22]。

对于炎症的治疗，常用糖皮质激素类甾体抗炎药和非甾体抗炎药，前者易产生依赖性，且易引起肾上腺皮质功能衰退等不良反应，后者的胃肠道不良反应普遍，因此从天然药物中开发抗炎药物受到广泛关注。本研究发现，经DNCB诱导的ACD模型大鼠，其耳组织厚度、重量以及HE染色结果均表明耳组织发生肿胀与炎性反应，ACD模型大鼠血清中检测到IL-6和IFN-γ含量升高，IL-10含量降低，而耳组织中同样可见NF-κB p65蛋白表达上调，这说明大鼠处于应激状态发生了严重的炎性反应。FFK能够显著降低ACD大鼠的耳组织肿胀，下调血清中IL-6和IFN-γ，上调IL-10，同时抑制耳组织中NF-κB p65蛋白的表达，提示FFK对于NF-κB p65具有显著的下调作用，而这一下调作用在ACD模型大鼠中表现为抗炎药理活性。上述结果提示，FFK对于DNCB诱导的ACD大鼠炎性反应具有明显的改善作用，其可能通过下调NF-κB p65表达，抑制炎症相关因子从而发挥抗炎作用。

[参考文献]

[1]  国家药典委员.中华人民共和国药典[S].一部.北京：国家医药科技出版社，2015：123-124.

[2]  Matsuda H，Dai Y，Ido Y，et al. Studies on Kochiae Fructus Ⅲ. Antinociceptive and Antiinflammatory Effects of 70% Ethanol Extract and Its Component，Momordin Ic from Dried Fruits of Kochia Scoparia L[J]. Biol Pharm Bull，1997，20（10）：1086-1091.

[3]  Matsuda H，Dai Y，Ido Y，et al. Studies on Kochiae Fructus Ⅳ. anti-allergic effects of 70% ethanol extract and its component，momordin Ic from dried fruits of Kochia Scoparia L [J]. Biol Pharm Bull，1997，20（11）：1165-1170.

[4]  Shin KM，Kim YH，Park WS，et al. Inhibition of Methanol Extract from the Fruits of Kochia Scoparia on Lipopolysaccharide-Induced Nitric Oxide，Prostagladin E2，and Tumor Necrosis Factor-ALPHA. Production from Murine Macr-ophage RAW 264.7 Cells [J]. Biol Pharm Bull，2004，27（4）：538-543.

[5]  Lu C，Zhang HY，Ji J，et al. In vivo anthelmintic activity of Dryopteris crassirhizoma，Kochia scoparia，and Polygala tenuifolia against Dactylogyrus intermedius （Monogenea） in goldfish （Carassius auratus）[J]. Parasitol Res，2012，110（3）：1085-1090.

[6]  王建農，刘青云，姚春海，等.地肤子“杀虫止痒”外用功能规范研究[J].中药材，2012，35（12）：1974-1977.

[7]  李培源，卢汝梅，苏炜，等.地肤子总黄酮含量测定及其抗氧化活性[J].湖北农业科学，2016，55（7）：1802-1804.

[8]  张浩，易华，张欣，等.地肤子黄酮类提取物的抗氧化活性研究[J].化工时刊，2012，26（7）：30-32.

[9]  张竞怡，王文杰，史欢，等.地肤子中总黄酮提取工艺及抗氧化性研究[J].浙江农业科学，2011（6）：1340-1344.

[10]  Kim JS，Park YM，Jin BJ，et al. Effect of les on recovery capability of DNCB-induced allergic contact dermatitis in rat [J]. J Life Sci，2011，21（5）：713-719.

[11]  Yuan Y，Tong L，Wu S. microRNA and NF-kappa B [J]. Adv Exp Med Biol，2015，887：157-170.

[12]  Lei L，Wang W，Xia C，et al. Salmonella Virulence Factor SsrAB Regulated Factor Modulates Inflammatory Responses by Enhancing the Activation of NF-kappa B Signaling Pathway [J]. J Immunol，2016，196（2）：792-802.

[13]  Liang J，Wang C，Peng J，et al. Naringin regulates cholesterol homeostasis and inhibits inflammation via modulating NF-kappa B and ERK signalling pathways in vitro [J]. Pharmazie，2016，71（2）：101-108.

[14]  李邻峰.皮炎湿疹类皮肤病诊疗进展[J].继续医学教育，2006，20（23）：28-32.

[15]  王德旭，张炜，苏东宝，等.皮炎湿疹致病因素分析[J].中国麻风皮肤病杂志，2008，24（5）：396-397.

[16]  William DJ，Timothy GB，Dirk ME. Anderws′ diseases of the skin，clinical dermatology [M]. 10th ed. Philadelphia：WB Saunders，2006：77-82.

[17]  Goriely S，Cavoy R，Goldman M. Interleukin-12 family members and type Ⅰ interferons in Th17-mediated inflammatory disorders [J]. Allergy，2009，64（5）：702-709.

[18]  Ding HL，Wang XL，Wang HW，et al. Successful treatment of refractory facial acne using repeat short-cycle ALA-PDT：case study [J]. Photodiagnosis Photodyn Ther，2011， 8（4）：343-346.

[19]  Yung A，Stables GI，Fernandez C，et al. Microbiological effect of photodynamic therapy （PDT） in healthy volunteers：a comparative study using methyl aminolaevulinate and hexylaminolaevulinate cream [J]. Clin and Exp Dermatol，2007，32（6）：716-721.

[20]  Wang C，Yuan J，Wu HX. Total glucosides of paeony inhibit the inflammatory responses of mice with allergic contact dermatitis by restoring the balanced secretion of pro-/anti-inflammatory cytokines [J]. Int Immunopharmacol，2015， 24（2）：325-334.

[21]  Huang WY，Wang J，Liu YM. Inhibitory effect of Malvidin on TNF-α-induced inflammatory response in endothelial cells [J]. Eur J Pharmacol，2014，723：67-72.

[22]  Martin SF，Esser PR，Weber FC，et al. Mechanisms of chemical-induced innate immunity in allergic contact dermatitis [J]. Allergy，2011，66（9）：1152-1163.