魏光强，陈越，卓加珍，赵存朝，王雪峰,2*，黄艾祥

1(云南农业大学 食品科学技术学院，云南 昆明，650201) 2(云南省畜产品加工工程技术研究中心，云南 昆明，650201) 3(云南省农业科学院生物技术与种质资源研究所，云南 昆明，650223)

酸奶是指以鲜牛乳为主要原料，经均质、杀菌处理后接种嗜热链球菌和保加利亚乳杆菌等有益乳酸菌发酵而制成的具有特殊风味的乳制品[1-2]。酸奶的口感和风味与酸度、pH、持水力、黏度、氨基酸和脂肪酸等密切相关，保加利亚乳杆菌和嗜热链球菌在牛乳发酵过程中能促进牛乳的酸化和成形，乳酸可降低胃液pH值，抑制肠道内有害菌的生长，有益人体健康。乳中脂肪酸含量一般在3%～5%，但发酵后乳中脂肪酸含量比生乳有所提高，发酵过程乳中蛋白质水解还会产生一些更易吸收的生物多肽和氨基酸[3]，以及其他具有生物活性的物质[4]，酸奶中的氨基酸不仅有益肠道健康，同时在转氨酶作用下可伸展成线性的酪蛋白分子，凝结成具有网络结构的凝胶状态，使酸奶具有一定的黏度，进而影响着酸奶的组织状态和外观[5-10]。

李宏军等[6]研究了齐齐哈尔市4个品牌酸奶在不同贮存温度下酸度和pH值的变化；朱秋劲等[7]研究了酸奶的加工贮藏过程中酸度、黏度和色度的变化；郭清泉等[11]研究了普通酸奶制品在12 ℃贮存时酸度和发酵剂菌数量的变化趋势；李云龙等[8]研究了酸奶在贮存过程中脂肪酸含量的变化；王芳等[9]研究了低温酸奶储存过程中氨基酸含量变化。现有研究多集中在酸奶贮藏过程的理化指标、微生物数量及一些风味成分变化，而对酸奶从生产加工到贮藏整个过程的理化指标、乳酸菌活菌数及主要风味成分变化的研究较少。本研究主要对酸奶从发酵到冷藏整个阶段的pH值、酸度、持水力、黏度等理化指标、乳酸菌活菌数及氨基酸、脂肪酸等风味成分含量进行测定分析，以期为酸奶及发酵乳制品的研发、生产、品质评价分析等提供一定的理论参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 原料乳

鲜牛乳，云南昆明奶牛牧场提供。

1.1.2 菌种

嗜热链球菌(Streptococcusthermophilus，CICC 6063)、保加利亚乳杆菌(Lactobacillusbulgaricus，CICC 6064)：由中国工业微生物菌种保藏中心提供。菌株使用前进行活化， 4 ℃冰箱储存备用。

1.1.3 试剂

焦性没食子酸、乙醚、无水硫酸钠、苯酚、NaCl(分析纯)：天津市风船化学试剂科技有限公司；乙腈、甲醇(色谱纯)：德国默克股份两合公司；正庚烷(色谱纯)：上海金贸泰化工有限公司；氨基酸标准溶液：天津博纳艾杰尔科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HPX-9272ME恒温培养箱，上海博讯实业有限公司；DW-HL398S超低温冰箱，中科美菱低温科技股份有限公司；SVJ-358智能商用型酸奶机，北京世纪阳光科技发展有限公司；PHSJ-3F型pH计，上海仪电科学仪器股份有限公司；DV-79B数字式黏度计，上海尼润智能科技有限公司；MD2OO-2氮吹仪，杭州奥盛仪器有限公司；Agilent 1200型高效液相色谱仪、Agilent 7890A型气相色谱仪，美国安捷伦科技有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 酸奶加工工艺

原料乳(验收，冷贮)→预热(50～60 ℃)→均质(8～10MPa均质)→灭菌(巴氏杀菌65 ℃，30 min)→冷却(30～45 ℃)→接种(嗜热链球菌∶保加利亚乳杆菌=1∶1)→发酵(38～42 ℃，10 h)→冷藏后熟(2～4 ℃)。

1.3.2 酸奶发酵、冷藏过程中理化指标分析

发酵阶段从发酵6 h(F6)开始，每隔2 h测定1次直至发酵10 h(F10)结束完成发酵阶段的测定，冷藏阶段1～6 d(S12～S144)每隔12 h对各理化指标测定1次，做3组平行重复。

1.3.2.1 黏度和持水力测定

持水力参照HASSAN的方法测定；黏度使用DV-79B数字式黏度计直接测定。

1.3.2.2 酸度、pH值测定

酸度测定采用酸碱滴定法；pH值测定采用PHSJ-3F型pH计直接测定。

1.3.2.3 乳酸菌活菌数测定

参照GB 4789.35—2016《食品安全国家标准食品微生物学检验乳酸菌检验》。

1.3.3 酸奶发酵、冷藏过程中氨基酸含量分析

1.3.3.1 样品处理及其衍生

参照王逍君等[10]、王雪峰等[11]的方法并进行修改。准确称取2.0 g酸奶，置于20～30 mL安瓿瓶中，加入10 mL含0.1%(质量分数)苯酚的6 mol/L HCl，振摇使酸奶溶解或均匀分散于溶液中，将安瓿瓶置于-20 ℃冰箱中冷冻3～5 min后取出充氮后用喷灯熔封并置于110 ℃左右的烘箱中水解24 h，取出冷却，从中取水解液1 mL置浓缩仪浓缩至干，加入1 mL 0.1 mol/L稀HCl溶解后用0.45 μm滤膜过滤。然后准确量取氨基酸标准溶液及样品水解液200 μL，分别置于1.5 mL离心管中，往每个离心管中准确加入正亮氨酸内标溶液20 μL，每个离心管中分别加入三乙胺乙腈溶液100 μL、异硫氰酸苯酯乙腈溶液100 μL，混匀，室温放置1 h，然后加入正己烷400 μL至各离心管，振摇后放置10 min，取下层溶液(PTC-AA)，用0.45 μm针式滤器过滤，取滤液200 μL加800 μL水稀释，摇匀，待测。

1.3.3.2 高效液相色谱法(HPLC)测定氨基酸含量

样品进行预处理后按照如下方法进行测定。Venusil AA氨基酸分析柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；色谱条件：柱温40 ℃；进样量：10 μL；波长：254 nm；流速：1.0 mL/min；流动相A：在1 850 mL的蒸馏水中加入15.2 g无水乙酸钠进行溶解，溶解后用冰醋酸将pH值调至6.5，最后加140 mL乙腈，混匀，用0.45 μm滤膜过滤；流动相B：80%乙腈溶液；洗脱梯度如表1所示。

表1 流动相梯度 单位：%

氨基酸质量浓度和总氨基酸含量如公式(1)和公式(2)。

(1)

式中:f1为样品溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积；f2为混合氨基酸标准溶液中各氨基酸峰面积/内标峰面积；C为氨基酸对照品质量浓度，μg/mL。

(2)

式中:P为氨基酸质量浓度，g/mL；V为样品溶液的定容体积，mL；W为样品质量，g。

1.3.4 酸奶发酵、冷藏过程中脂肪酸含量分析

1.3.4.1 样品预处理

参照郑玉梅等[8]的方法进行样品预处理。

1.3.4.2 气相色谱法(GC)测定脂肪酸含量

样品进行脂肪提取、皂化和甲酯化预处理后按照如下方法进行测定。CD-2560毛细管柱(100 mm×0.25 mm×0.20 μm)；气相色谱检测条件：初始温度130 ℃，保持5 min，以4 ℃/min升温到240 ℃，保持20 min，进样口温度250 ℃，分流比100∶1，氢火焰离子检测器温度为240 ℃，载气为高纯度氦气和氢气，流速为1 mL，进样量为1.0 μL。

数据处理：以保留时间定性，面积百分比法定量(归一化法)计算如公式(3)所示：

(3)

式中:Ai为第i个组分的峰面积；∑Ai为第i个组分的所有峰面积之和。

1.4 数据处理及统计分析

每个样品至少3次重复数据，以平均值(AV)±标准差(SD)表示。通过SPSS 17.0软件对数据进行方差显著性分析，P<0.05表示差异显著。

2 结果与分析

2.1 酸奶发酵、冷藏过程中理化指标分析

2.1.1 酸奶发酵、冷藏过程中黏度和持水力测定

黏度是评价酸奶口感的一个重要指标，黏度的变化与其酸度变化、蛋白质凝胶的形成直接相关，并影响酸奶的质构和稳定性，在乳发酵的过程中与蛋白质相互作用，改变了酪蛋白的结构，从而增加酸奶的黏度。酸奶发酵、冷藏过程中黏度和持水力的变化如图1所示。

图1 酸奶发酵、冷藏过程中黏度和持水力变化Fig.1 Changes in viscosity and water holding capacity of yogurt during the fermentation and refrigeration注：F表示发酵期；S表示冷藏期。下同。

由图1可以看出，在发酵初期黏度变化趋势较为缓和，原因在于此时处于发酵初始阶段，pH值较高，酪蛋白溶解度增大，黏度值低，且牛奶中包含的天然缓冲体系也发挥了一定作用；随着发酵时间的延长，pH值降低，黏度增加，原因是pH值较低，解离下来的酪蛋白重新聚合形成具有网络结构的稳定凝胶状态，溶解度降低，黏度增大[12]。冷藏初期黏度显著增加，在冷藏84 h达到最高值为508.33 MPa·s，原因是在冷藏初期pH值低，酪蛋白继续聚合，另外在进入冷藏阶段后温度迅速降低，热运动变得较为缓慢，也促进酸奶黏度增大[12]。冷藏后期，由于发酵产酸，导致乳中微小蛋白质亚胶体分子团改变，亲合连接作用减弱，进而导致乳胶体的刚性降低，蛋白质网络变得松散，酸乳黏度降低[13-14]，第6天时黏度为461.33 MPa·s。

酸奶从发酵至冷藏阶段的持水力和黏度变化在趋势上成正比，这是因为酸奶的持水能力是由凝乳微粒的表面积与凝乳微粒的重量之比决定的，这个比值越高，持水力就越大[15]。发酵阶段的持水力变化不大，发酵初期酪蛋白结构遭到破坏使溶解度增大，但同时酪蛋白与水之间存在的静电作用又使酸奶具有一定的持水力[15]；从发酵至冷藏阶段持水能力显著增加，在冷藏84 h达到最高值为55.98%，可能原因是此时解离的酪蛋白重新聚合形成具有网络结构的稳定凝胶状态，酪蛋白之间的空隙很好地包裹了水分，所以持水力增加[16-17]，之后又缓慢下降的原因是高酸度情况下对酪蛋白凝胶结构有一定的破坏造成持水力降低、乳清析出[18]。

2.1.2 酸奶发酵、冷藏过程中pH值和酸度测定

pH值和酸度与酸奶的风味和品质密切相关，pH值和酸度变化会导致酸奶的酸味太重、乳清沉淀析出、感官质量下降，使酸奶的风味发生较大变化[19]。酸奶发酵、冷藏过程中pH值和酸度变化如图2所示。

图2 酸奶发酵、冷藏过程中pH值、酸度变化Fig.2 Changes in pH value and acidity of yogurt during the fermentation and refrigeration注：RM代表发酵初期。

由图2可知，F6～F10 h是乳酸菌产酸的主要时期，pH值由5.46下降到3.67，酸度由73.53oT升高到87.77oT，差异显著(P<0.05)，其主要原因是保加利亚乳杆菌分解蛋白产生的多肽和氨基酸刺激嗜热链球菌将乳糖代谢成乳酸，还有产生的各种氨基酸对酸奶pH值的降低也有一定的影响[20]。冷藏过程中酸奶的pH值平缓下降，差异不显著(P>0.05)，原因是乳酸菌的继续生长繁殖消耗剩余的乳糖产生乳酸，进一步酸化[21]。冷藏期间的酸度在85.97～94.13oT，达到GB 5413.34-2010中酸乳制品规定的酸度值(70～110oT)。

2.2 酸奶发酵、冷藏过程中乳酸菌活菌数变化分析

酸奶中乳酸菌活菌数是评价产品对人体营养与健康作用的重要指标，GB 4789.35—2016中规定产品中的乳酸菌数不得低于1×106CFU/mL。酸奶发酵过程中，乳酸菌的生长繁殖及产生的代谢产物会引起酸奶产品发生一系列变化，乳酸菌活菌数对酸奶的发酵风味、货架期长短有直接影响。酸奶发酵、冷藏过程中的乳酸菌活菌数变化如图3所示。

图3 酸奶发酵、冷藏过程中乳酸菌活菌数变化Fig.3 Changes in the number of lactic acid bacteria of yogurt during the fermentation and refrigeration

由图3可知，酸奶在发酵6～8 h是乳酸菌生长的对数期，乳酸菌数量急剧增加，发酵8～10 h时缓慢增加；在发酵至冷藏过度阶段乳酸菌数量迅速降低，这是因为该阶段低温低酸的环境已经不再适合乳酸菌微弱的生长，乳酸菌数迅速减少[22]。在冷藏后

期，乳酸菌数目逐渐上升，在第5天即冷藏120 h时达到最大值为7.15×109CFU/mL，之后缓慢下降，可能原因是此时pH值较低，引起细胞膜电荷变化，改变其通透性，从而影响乳酸菌对营养物质的吸收以及胞内酶的活性，因而乳酸菌的生长受到抑制，甚至死亡。

2.3 酸奶发酵、冷藏过程中氨基酸含量变化分析

乳酸菌在发酵过程中能降解蛋白质为小肽，然后转化成各种氨基酸供其利用，且氨基酸能影响发酵乳质构特性、营养、风味等[23]，如添加半胱氨酸能增加发酵乳稠度；同时乳酸菌进行氨基酸代谢可产生风味物质，从而影响发酵乳风味[24]。本试验采用HPLC对酸奶中的氨基酸含量进行检测，样品氨基酸HPLC色谱图如图4所示，酸奶发酵、冷藏过程中的氨基酸种类及含量变化如表2所示。

图4 酸奶发酵、冷藏过程中氨基酸分析色谱图Fig.4 Amino acid analysis chromatogram of yogurt during the fermentation and refrigeration

表2 酸奶发酵、冷藏过程中氨基酸含量变化 单位：mg/g

注：“E”表示必需氨基酸，“F”表示鲜味氨基酸。同一行上标小写字母不同表示差异显著(P<0.05)。下同。

由表2可知，酸奶总氨基酸含量和必需氨基酸含量在发酵6～10 h持续上升，变化显著(P<0.05)，原因是此阶段pH值在5.2～5.8，保加利亚乳杆菌有效分解蛋白产生大量氨基酸，发酵到10 h含量最高分别为1 311和546 mg/g。冷藏后熟过程中总氨基酸数量先降后升，原因是蛋白质水解成氨基酸的过程和乳酸菌利用氨基酸的过程同时存在，乳酸菌受到低温的影响，蛋白质代谢活性受到极大抑制，氨基酸产量下降，此后蛋白质的水解作用占主导，氨基酸含量开始增加，该变化与MENG等[25]的研究结果一致。

发酵、冷藏过程中必需氨基酸中亮氨酸的含量显著高于其他氨基酸，在发酵过程中最高含量为168 mg/g、冷藏过程中最高含量为107 mg/g；其次是赖氨酸，赖氨酸是亲水氨基酸中的碱性氨基酸；蛋氨酸和其他氨基酸相比，含量较少，蛋氨酸为含硫氨基酸，其在发酵及冷藏过程中被降解成含硫的香气化合物。鲜味氨基酸在发酵6～10 h持续上升，发酵10 h含量达到最大值为811 mg/g，变化显著(P<0.05)，在冷藏前期趋于平缓，冷藏96 h时达到最大值后又开始下降，鲜味

氨基酸中谷氨酸的含量最高为163 mg/g。

2.4 酸奶发酵、冷藏过程中脂肪酸含量变化分析

酸奶的香气和风味主要来源于非挥发性酸、挥发性酸和羰基化合物，其中挥发性成分的浓度决定了最终风味的组成，以C2～C10脂肪酸为主的挥发性脂肪酸会产生酸奶气味中的主要酸味感[26]。本试验采用GC对酸奶进行脂肪酸含量检测，样品脂肪酸GC色谱图如图5所示，酸奶在发酵、冷藏过程中的脂肪酸种类及含量变化如表3所示。

图5 酸奶发酵、冷藏过程中脂肪酸分析色谱图Fig.5 Fatty acid sample chromatogram of yogurt during the fermentation and refrigeration

表3 酸奶发酵、冷藏过程中脂肪酸相对含量变化 单位：%

注：“SFA”表示饱和脂肪酸；“MUFA”表示单不饱和脂肪酸；“PUFA”表示多不饱和脂肪酸；“SCFA”表示短链脂肪酸；“MCFA”表示中链脂肪酸；“LCFA”表示长链脂肪酸。

由表3可知，脂肪酸含量在发酵、冷藏期间持续上升，但都没有达到显著的水平(P>0.05)，发酵到10 h时长链脂肪酸含量最高，占总脂肪酸含量的69.839%，在冷藏阶段长链脂肪酸含量最高值占总脂肪酸含量的70.124%，其原因是在整个过程中氨基转移酶代谢为酮酸类物质，最终转化为醛、醇及脂肪酸类物质[27]；饱和脂肪酸相对含量最高的为十六烷酸，其次是十四烷酸；在单不饱和脂肪酸中相对含量最高的是油酸23.629%，多不饱和脂肪酸中相对含量最高的是十八碳二烯酸为8.177%。单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸在整个发酵、冷藏过程逐渐降低，但都没有达到显著的水平(P>0.05)，原因是单不饱和脂肪酸和多不饱和脂肪酸发生氧化反应，继而分解为气味阈值较低的羰基化合物[28]。酸奶中的短链脂肪酸含量在9%～11%，其比长链脂肪酸更易消化吸收，并且具有保健功效，在发酵、冷藏阶段短链脂肪酸逐渐增加，可能是乳酸菌的脂肪酶对短链脂肪酸表现出底物特异性，进一步促进短链脂肪酸的生成[29]。酸奶中长链脂肪酸的含量较高，在69%左右，发酵后长链脂肪酸从69.066%增加至70.124%，这与孟和毕力格等[30]的研究结果一致，可能是因为发酵促进了乳中的中、长链脂肪酸发生氧化降解生成挥发性脂肪酸和大量乙酰辅酶A，乙酰辅酶A进一步羧化生成丙二酸单酰辅酶A，在脂肪酸合成酶作用下经缩合、还原、脱水、还原一系列反应重新合成长链脂肪酸，这是发酵剂中脂肪酸降解酶、合成酶综合作用的结果。

3 结论

本试验测定了酸奶在发酵、冷藏过程中的pH值、酸度、持水力、黏度等理化指标，乳酸菌活菌数和氨基酸、脂肪酸等风味成分含量。酸奶持水力、黏度、酸度、pH值等理化指标在发酵阶段出现显著变化，冷藏阶段变化缓慢；酸奶乳酸菌活菌数在发酵、冷藏阶段表现为逐渐增加—迅速降低—缓慢上升的趋势；氨基酸总量、必需氨基酸和非必需氨基酸含量在发酵、冷藏阶段表现为逐渐上升—迅速降低—缓慢上升的趋势；脂肪酸含量在发酵、冷藏期间持续上升，其中多不饱和脂肪酸在整个发酵、冷藏阶段逐渐降低，而短链脂肪酸、中链脂肪酸及长链脂肪酸逐渐增加。充分探讨了酸奶发酵及冷藏过程中理化指标、乳酸菌活菌数及主要风味成分变化情况，旨在为酸奶及发酵乳产品的研发、生产、品质评价分析提供理论数据参考。