胡晓倩,李长江,吴永祥,祁路路,王玉芹,黄辉,韩婷婷

1 (黄山学院 生命与环境科学学院,安徽 黄山, 245041) 2 (黄山学院 化学化工学院,安徽 黄山, 245041)

徽州呈坎罗氏毛豆腐是原产地保护的著名大豆发酵食品，“呈坎罗氏”是其自主品牌商标，入选非物质文化遗产，是“世博会”指定产品和“舌尖上的中国”报道产品，是不添加任何添加剂及防腐剂的绿色、独特、地方性和传承性的产品。

过量自由基能引发组织细胞病变，组织细胞病变可引起各种疾病发生和加速机体衰老，通过阻断过氧化链式反应减少或消除自由基，可预防或减少疾病的发生，且具有防癌、抗癌的作用[1]。体内过剩自由基能够被具有抗氧化活性的物质有效的清除，对具有抗氧化活性功能的食品的研究极具现实意义。

目前学术界对于毛豆腐的研究主要集中在毛豆腐发酵技术与化学成分的分析[2]，对毛豆腐的抗氧化功能研究甚少。本实验通过对非遗产品徽州呈坎罗氏毛豆腐基本营养成分的检测、浸提液的制备及其体外抗氧化活性(总还原力及对自由基清除能力)的测定，旨在为非遗产品徽州呈坎罗氏毛豆腐功能机制研究及功能产品开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料、试剂与设备

1.1.1 材料

非遗产品徽州呈坎罗氏毛豆腐，由安徽省黄山市呈坎罗氏毛豆腐工作坊提供。普通毛豆腐1和普通毛豆腐2，购自安徽省黄山市阳湖菜市场的两家不同商家。

1.1.2 试剂

乙醇、甲醇、磷酸盐缓冲液(pH 6.6)、铁氰化钾、三氯乙酸、FeCl3、三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl，pH 8.2)、邻苯三酚、HCl、硫酸亚铁、水杨酸、过氧化氢、1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(DPPH)、2′-联氨-双-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(ABTS)、Vc、过硫酸钾等，均为分析纯。实验用水均为蒸馏水。

1.1.3 仪器与设备

TDL-5台式低速离心机,上海安亭科学仪器厂; HH-S恒温水浴锅,江苏省金坛市医疗仪器有限公司; YP3001N电子天平,上海精密科学仪器有限公司; pH酸度计,梅特勒-托利多仪器上海有限公司; SX4-10箱式电阻炉,上海树立仪器仪表有限公司; LPCD-E3000电热恒温鼓风干燥箱,上海龙跃仪器设备有限公司; FL-1电子万用炉,北京市永光医疗仪器有限公司; Microfuge 20R台式高速冷冻离心机,贝克曼库尔特商贸中国有限公司; SpectraMax-190型全波长酶标仪,美国Moleculear Devices公司。

1.2 实验方法

1.2.1 毛豆腐营养成分检测

呈坎罗氏毛豆腐和普通毛豆腐，同时进行以下营养成分指标的检测，以示比较。实验数据均为平行测定3次取平均值。

(1)pH值测定

pH酸度计测定。

(2)水分测定

按照食品安全国家标准食品中水分测定的标准和方法(GB/T 5009.3—2010)进行测定[3]。

(3)灰分的测定

按照食品安全国家标准食品中灰分测定的标准和方法(GB/T 5009.4—2016)进行测定[4]。

(4)蛋白质含量的测定

用BCA法蛋白含量测定试剂盒进行测定。

(5)可溶性总糖含量的测定

采用蒽酮比色法测定[5]。以标准品葡萄糖含量X为横坐标，A620为Y纵坐标，绘制标准曲线并得线性回归方程Y=2.123 7X-0.001 2，R2=0.994 1，葡萄糖标准品在10～80 μg/mL时与A620呈良好的线性关系。将待测样品溶液测得的吸光值代入葡萄糖标准曲线中，计算样品溶液的含糖量，并换算为100 g毛豆腐样品中的总糖含量表示(g/100 g)。

(6)Vc含量的测定

采用2，4-二硝基苯肼比色法测定[6]。以标准品Vc含量X为横坐标，A500为Y纵坐标，绘制标准曲线并得线性回归方程Y=0.011 3X-0.0013，R2=0.996 7， Vc标准品在1.6～8 μg/mL时与A500呈良好的线性关系。将待测样品溶液测得的吸光值代入Vc标准曲线中，计算样品溶液的Vc含量,并换算为100 g毛豆腐样品中的Vc含量，mg表示(mg/100 g)。

1.2.2 呈坎罗氏毛豆腐浸提液单因素设置和制备

将呈坎罗氏毛豆腐研磨成糊状，精准称取5、10、 20 g置于烧杯中，加入100 mL蒸馏水作为溶剂，搅拌均匀后静置60 min，得单因素料液比的1∶20、1∶10、 1∶5三个水平；再在单因素浸提温度的35 ℃(接近体温)和100 ℃(接近烹饪的蒸煮温度)这2个水平的恒温水浴锅中浸提60 min，室温下静置冷却至室温，2 000 r/min离心15 min，再在4 ℃, 14 000 r/min离心30 min，取上清液为浸提液，置4 ℃冷藏备用。每个水平的实验均重复3次。

1.2.3 呈坎罗氏毛豆腐浸提液的可溶性固形物含量测定

采用干燥法测定[7]。选取干燥称量容器，称重后将重量记为W0。加入1 mL浸提液(按照1.2.2制备)，称重后记为W1。90 ℃烘30 min，然后将烘箱温度调为105 ℃，烘1.5 h后拿出，再放入干燥器中干燥30 min，称重后记为W2(一定要达到恒重，即质量差值小于0.2 mg)。每个水平浸提液均平行做3份。按照公式(1)计算可溶性固形物含量。

(1)

1.2.4 呈坎罗氏毛豆腐浸提液体外抗氧化活性检测

(1)呈坎罗氏毛豆腐浸提液总还原力的测定

采用普鲁士蓝法[8]。用合适浓度的Vc水溶液做参照，评价浸提液的总还原力。每个水平浸提液重复3次。

(2)呈坎罗氏毛豆腐浸提液对超氧阴离子清除能力的测定

采用邻苯三酚自氧化法[9-11]。用合适浓度的Vc水溶液做参照，评价浸提液对超氧阴离子的清除能力。每个水平浸提液重复3次。

(3)呈坎罗氏毛豆腐浸提液对羟自由清除能力的测定

采用水杨酸捕获羟自由基法[12-13]。用合适浓度的Vc水溶液做参照，评价浸提液对羟自由基的清除能力。每个水平浸提液重复3次。

(4)呈坎罗氏毛豆腐浸提液对DPPH自由基清除能力的测定

采用DPPH法[14-16]。用合适浓度的Vc水溶液做参照，评价浸提液对DPPH自由基的清除能力。每个水平浸提液重复3次。

(5)呈坎罗氏毛豆腐浸提液对ABTS自由基清除率的测定

采用ABTS法[17-18]。用合适浓度的Vc水溶液做参照，评价浸提液对ABTS自由基的清除能力。每个水平浸提液重复3次。

1.2.5 呈坎罗氏毛豆腐浸提液体外抗氧化活性数据统计学分析

采用SPSS18.0统计分析软件对数据进行单因素方差分析(One-way ANOVA)，利用Duncan′s多重比较法分析样本间的差异显著性，P<0.05认为样本间具有显著差异。所有实验重复3次，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 呈坎罗氏毛豆腐和普通毛豆腐的营养成分检测结果

营养成分检测结果见表1，普通毛豆腐的pH值波动较大，呈现不稳定的状态，而呈坎罗氏毛豆腐的pH值很稳定，呈弱碱性。呈坎罗氏毛豆腐的水分、灰分、可溶性总糖和Vc含量都略高于普通毛豆腐。呈坎罗氏毛豆腐的蛋白质含量达到20.830 gmL，远高于普通毛豆腐的蛋白质含量。相比普通毛豆腐，徽州呈坎罗氏毛豆腐具有更高的营养价值。

表1 呈坎罗氏毛豆腐和普通毛豆腐的营养成分检测结果Table 1 The results of nutritional components in Luo’s hariy toufu and the oridinary hariy toufu

2.2 呈坎罗氏毛豆腐浸提液的总还原力

还原能力强的物质因其化学本质为还原剂，将会是良好的电子供体，研究发现总还原力与物质的抗氧化活性呈正相关[19]。一般情况下具有较强还原能力的物质能够把Fe3+还原成Fe2+，根据显色反应可以判断其还原程度，反应后的吸光度越大的物质其还原能力越强[20]。呈坎罗氏毛豆腐浸提液和对照品Vc的总还原力实验测定的A700数值如表2所示。

由表2可知，2个单因素的不同水平得到的浸提液的总还原力具有统计学显著差异(P<0.05)。料液比降低，可溶性固形物含量增加，总还原力增加；相同的料液比，浸提温度从35 ℃(接近体温)升高到100 ℃(接近食品加工蒸煮温度)，可溶性固形物含量和总还原力均明显增加。以Vc为参照，料液比同为1∶5，35 ℃的浸提液的总还原力，与25 μg/mL的Vc相当，而100 ℃浸提液的总还原能力明显提升，与50 μg/mL的Vc相当。实验结果表明，呈坎罗氏毛豆腐浸提液具有一定的抗氧化能力，浸提温度的升高，有利于浸提液可溶性固形物中活性成分的有效释放并促进总还原力的提升。

表2 呈坎罗氏毛豆腐浸提液的总还原力Table 2 The reducing power of the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)；“-”表示未检出。

2.3 呈坎罗氏毛豆腐浸提液对超氧阴离子自由基的清除能力

呈坎罗氏毛豆腐浸提液和对照品Vc对超氧阴离子自由基的清除率如表3所示。由表3可知，2个单因素的不同水平得到的浸提液，其对超氧阴离子自由基的清除率有统计学显著差异(P<0.05)。浸提液对超氧阴离子自由基的清除率，随着料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提温度升高而呈现增加趋势。以Vc为参照，实验中的不同浸提液，对超氧阴离子均有较好的清除能力，基本高于120 μg/mL的Vc，而且，料液比为1∶5的100 ℃浸提的毛豆腐浸提液，清除能力已超过200 μg/mL Vc溶液的清除能力，说明呈坎罗氏毛豆腐浸提液对超氧阴离子有较好的清除能力。

表3 呈坎罗氏毛豆腐浸提液对超氧阴离子自由基的清除率Table 3 The scavenging activity of the different extracts of Luo's hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05);“-”表示未检出。

2.4 呈坎罗氏毛豆腐浸提液对羟自由基的清除能力

呈坎罗氏毛豆腐浸提液和对照品Vc对羟自由基的清除率如表4所示。由表4可知，2个单因素的不同水平得到的浸提液，其对羟自由基的清除率有统计学显著差异(P<0.05)。浸提液对羟基自由基的清除率，随着料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提温度升高而呈现增加趋势。以Vc为参照，实验中的不同浸提液，对羟自由基均有较好的清除能力，介于120～600 μg/mL的Vc，料液比为1∶5的100 ℃浸提液对羟自由基的清除效果，已极大超过了200 μg/mL的Vc溶液的清除效果，与600 μg/mL的Vc溶液清除效果大致相同。实验结果表明，呈坎罗氏毛豆腐浸提液对羟自由基有较强的清除能力。

表4 呈坎罗氏毛豆腐浸提液对羟自由基的清除率Table 4 The scavenging activity of ·OH in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05);“-”表示未检出。

2.5 呈坎罗氏毛豆腐浸提液对DPPH自由基的清除能力

呈坎罗氏毛豆腐浸提液和对照品Vc对DPPH自由基的清除率如表5所示。由表5可知，两个单因素的不同水平得到的浸提液，其对DPPH自由基的清除率有统计学显著差异(P<0.05)。浸提液对DPPH自由基的清除率，随着料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提温度升高而呈现增加趋势。以Vc为参照，料液比为1∶5的35 ℃的浸提液对DPPH自由基的清除效果，与20 μg/mL Vc溶液的清除效果相当，而100 ℃浸提的毛豆腐浸提液对DPPH自由基清除能力，就明显高于20 μg/mL Vc溶液，说明呈坎罗氏毛豆腐浸提液对DPPH自由基有一定的清除能力。

表5 呈坎罗氏毛豆腐浸提液对DPPH自由基的清除率Table 5 The scavenging activity of DPPH· in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05)；“-”表示未检出。

2.6 呈坎罗氏毛豆腐浸提液对ABTS自由基的清除能力

呈坎罗氏毛豆腐浸提液和对照品Vc对ABTS自由基的清除率如表6所示。由表6可知，2个单因素的不同水平得到的浸提液，其对ABTS自由基的清除率有统计学显著差异(P<0.05)。浸提液对ABTS自由基的清除率，随着料液比降低、可溶性固形物含量增加或浸提温度升高而呈现增加趋势。以Vc为参照，实验中的不同浸提液，对ABTS自由基均有较好的清除能力，介于40～200 μg/mL的Vc，料液比为1∶5的100 ℃浸提的毛豆腐浸提液对ABTS自由基的清除效果与200 μg/mL的Vc溶液相当。实验结果表明，呈坎罗氏毛豆腐浸提液对ABTS自由基有较好的清除能力。

表6 呈坎罗氏毛豆腐浸提液对ABTS自由基的清除率Table 6 The scavenging activity of ABTS· in the different extracts of Luo′s hairy toufu in Chengkan village

注：同列不同字母表示在统计学上具有显著差异(P<0.05);“-”表示未检出。

3 结论

在众多的植物性蛋白质中，只有大豆蛋白能提供所有的必需氨基酸，是联合国粮农组织指定的优质蛋白，成为越来越重要的植物蛋白资源[21-22]。本研究综合对比分析了徽州呈坎罗氏毛豆腐和普通毛豆腐的基本营养成分(pH、水分、灰分、蛋白质含量、总糖含量、Vc含量)，结果显示徽州呈坎罗氏毛豆腐蛋白质、Vc以及可溶性总糖的含量高于普通毛豆腐，具较高的营养价值。

Vc是重要的水溶性捕捉型抗氧化物，能清除活性氧自由基，具抗衰老、预防心血管疾病等多种生理功能，促进人体正常生理代谢的平衡[23-24]。吴非等的研究显示，传统霉菌发酵豆制品具有较高的抗氧化活性[25]。徽州毛豆腐是将来自于大豆蛋白的豆腐自然接种毛霉菌，发酵4～7 d而成。在发酵过程中因微生物及酶的作用，在毛豆腐中产生了许多生物活性物质[2, 26]。本实验以不同浸提温度与料液比为因素水平，研究了徽州呈坎罗氏毛豆腐浸提液的抗氧化活性，以阐明不同加工方式对其功能活性的影响。结果表明，徽州呈坎罗氏毛豆腐浸提液具有较好的总还原力和对超氧阴离子自由基、羟自由基、DPPH自由基、ABTS自由基的清除能力。不同浸提温度与料液比对徽州呈坎罗氏毛豆腐浸提液抗氧化活性的影响显著。相比35 ℃(接近体温)的浸提液，100 ℃(接近食品加工蒸煮温度)的浸提液，其体外抗氧化能力明显增强。本研究首次阐明了非遗产品徽州呈坎罗氏毛豆腐的功能活性，并为其合理的加工方式提供了技术参考，为其成为可开发的抗氧化功能食品提供了理论依据。下一步将对100 ℃浸提的毛豆腐浸提液进行主要活性成分分析，以明确抗氧化活性的主要成分。