张志军，岳杰，尹花

(啤酒生物发酵工程国家重点实验室，青岛啤酒股份有限公司，山东 青岛，266100)

中国啤酒产量连续多年位居世界第一，但啤酒大麦长期依赖进口，主要来自加拿大、澳大利亚、法国等主要大麦产区，主流大麦品种已达20多种。麦芽是大麦经浸麦、发芽、焙焦后制成的，不同品种的麦芽在糖化、过滤、发酵、风味特征等方面存在较大差异。受利益驱使，某些经销商在高价麦芽中掺入低价麦芽，或者通过麦芽混掺将原本指标不合格的麦芽调配成为“优质麦芽”。麦芽掺假不仅给啤酒企业采购带来巨大的直接经济损失，还会对糖化、过滤和发酵过程带来间接的影响，最终影响啤酒品质的稳定性和一致性。因此，啤酒行业亟需建立一种准确、快速、经济的麦芽品种鉴定技术，从源头上保障啤酒原料的纯净性和一致性。

与传统的形态鉴别法和田间小区种植等农作物种子真实性鉴定技术相比，DNA分子标记具有周期短、重复性好、不受环境影响等优点，已在农作物指纹图谱构建、遗传多样性分析等方面得到了广泛应用[1-3]。作为第二代分子标记技术，简单重复序列(simple sequence repeat，SSR)具有多态性丰富、共显性遗传、扩增模式简单等典型特征[4]。国际植物新品种保护联盟(UPOV)在BMT分子测试指南中，将SSR作为DNA指纹数据库构建的主要方法。目前，SSR广泛应用于小麦、玉米、水稻等作物的指纹图谱构建、遗传多样性、品种鉴定分析等[5-12]。但国内外利用SSR进行麦芽品种鉴定方面的研究报道极少，谷方红等[13]利用5对SSR引物对国内外8个麦芽品种进行了区分，但文中并未给出具体的引物序列信息，品种数量较少，且使用的聚丙烯酰胺凝胶电泳存在分辨率低、无法准确读取扩增片段大小等缺点[14]，因此无法进行应用。

本实验室前期基于TP-M13荧光标记结合单重荧光PCR技术可对23个麦芽品种进行区分[15]，但由于毛细管电泳的试剂及引物成本较高，该法在大批量、多批次样品检测时存在检测周期长、成本高等缺点。随着电泳技术的发展，多重荧光PCR与毛细管电泳多重荧光检测技术的结合刚好可以解决这一难题。多重PCR(mutiplex PCR)是在同一个PCR反应体系中加入多对引物，针对一个或多个DNA模板扩增出多个目的片段的技术，更加高效、快捷、低成本。因此，在引物组合的设计时不仅要考虑引物在品种区分上的互补性、扩增稳定性，还要具有构建多重PCR体系的潜力。毛细管电泳多重荧光检测法是采用3对以上的引物组合构建多重荧光PCR反应体系，通过一次毛细管电泳同时检测3个以上的SSR位点，具有简便、可靠、低成本及高通量的优点，已在玉米、水稻、棉花等作物的指纹图谱构建及品种鉴定方面得到广泛的应用[16-24]。目前，利用毛细管电泳多重荧光进行麦芽品种核心引物筛选、多重PCR体系优化、指纹数据库构建等方面的研究尚无报道。

本研究基于毛细管电泳多重荧光检测技术，对前期筛选的引物进行组合设计，根据多重PCR体系优化的结果进行核心引物筛选，并利用核心引物构建国内外主要麦芽品种的指纹数据库，为麦芽品种和纯度鉴定提供一种快速、准确、低成本的高通量检测方法。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

收集24种啤酒大麦不同年份的72份样品作为试验材料，来源于加拿大、澳大利亚、法国等主要大麦产区，涵盖当前国际主流大麦品种，样品分别由加拿大啤酒大麦技术中心(CMBTC)、澳大利亚农作物育种公司(InterGrain)、法国酿造与制麦研究院(IFBM)等机构提供，见表1。

植物DNA提取试剂盒，北京百泰克公司；TaqDNA聚合酶、dNTPs，美国Sigma-Aldrich公司；GeXP遗传分析系统试剂，美国Sciex公司；荧光引物，北京英骏生物技术有限公司合成。

1.2 仪器与设备

96通道高通量核酸提取仪，北京百泰克公司；C1000 TouchTMPCR仪，美国Bio-Rad公司；GenomeLabTMGeXP遗传分析系统，美国Sciex公司；CK1000D高通量组织研磨仪，北京托摩根公司；5430型离心机，德国Eppendorf公司； NanoDrop 2000超微量分光光度计，美国Thermo Scientific公司。

1.3 试验方法

1.3.1 DNA提取

另一些有大理想的人则攻破一堵一堵的墙闯了进来，走到这个院落中心，在不知不觉中就变为这里的一分子，然后用那双毁墙的手，拾起满地散落的砖头，把墙重新垒起来，而且砌得又厚又高。

供试的大麦品种通过实验室制麦得到相应的麦芽样品，4 ℃保存。取单粒麦芽置于2.0 mL离心管中，加7 mm钢珠，高通量组织研磨仪1 200 r/min粉碎1 min。采用植物DNA提取试剂盒进行麦芽DNA提取，步骤参照说明书。利用0.8%琼脂糖凝胶电泳和NanoDrop 2000检测DNA纯度和浓度，DNA浓度统一稀释到20 ng/μL，-20 ℃保存备用。

表1 大麦品种及来源Table 1 Varieties and sources of barley

注：CWB，加拿大小麦局；CMBTC，加拿大啤酒大麦技术中心；InterGrain，澳大利亚农作物育种公司；IFBM，法国酿造与制麦研究院；红兴隆，黑龙江红兴隆农业科学研究院。

1.3.2 引物合成

根据本实验室前期引物筛选的结果[15,25]，选择分布于7条染色体的12对多态性丰富、具有单峰或双峰特征的引物进行合成，正向引物用Alexa Fluor 647(蓝)、Alexa Fluor 680(绿)和Alexa Fluor 750(黑)中的一种荧光进行标记，引物序列信息见表2。

1.3.3 PCR扩增

多重PCR反应体系为20 μL，包括4 μL 10×PCR Buffer、4 μL 25 mmol/L MgCl2、4 μL 2 mmol/L dNTP、0.7 UTaqDNA聚合酶、0.03～0.06 μmol/L正向引物和反向引物、样品DNA 20 ng。多重PCR反应程序为：94 ℃预变性3 min；94 ℃变性30 s，55～60 ℃ 退火30 s，72 ℃延伸1 min，共30个循环；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

1.3.4 毛细管电泳检测

取0.5 μL分子质量内标加入39.5 μL甲酰胺缓冲液，混合均匀，加入样品板中；取1 μLPCR产物加入上样板中，加石蜡油覆盖防止挥发；缓冲液板中添加3/4体积分离缓冲液。毛细管电泳进样电压2.0 kV，时间30 s，90 ℃变性2 min，分离电压6.0 kV，分离时间35 min。

1.4 数据分析

PCR产物分离过程中，GeXP遗传分析系统利用GeneMapper-V3.0软件对扩增产物的荧光信号强度进行收集、储存，参照分子质量内标得到图谱中各片段的大小。通过人工分析将电泳图谱中的特征峰判读为对应的等位基因，取3次重复的平均值并四舍五入取整，作为该品种的等位基因大小。电泳图谱中的单峰(纯合型)用X表示，双峰(杂合型)的主峰和次峰用X/Y表示。利用Power Marker V3.25软件分析等位基因数、计算多态性信息含量(PIC)，根据各品种等位基因大小进行麦芽品种DNA指纹数据分析。

表2 SSR引物序列信息Table 2 Information of SSR primer sequences

2 结果与分析

2.1 引物多态性分析

对本实验室前期单重PCR扩增的毛细管电泳图谱进行分析，剔除杂峰、非特异峰等特殊峰形的引物，选择等位基因数≥3且具有单峰或双峰特征的12对引物作为候选引物。利用12对基本引物对24个麦芽品种进行多态性分析，共检测到135个等位基因，每对引物3～11个，平均为5.63个。引物HVM68多态性最丰富，在165～299bp包含11个等位基因；引物scssr07759和scssr10559多态性最低，仅有3个等位基因。各引物的多态性信息含量变化为0.37～0.82，平均为0.68，表明不同麦芽品种间具有丰富的遗传多样性。引物多态性信息，见表3。

表3 SSR引物多态性分析Table 3 Analysis of SSR primer polymorphism

2.2 引物组合设计

本研究初选的12对多态性引物可实现全部24个麦芽品种的区分，考虑到快速、经济的检测要求，对引物进行组合设计。基于最少引物鉴定最多品种的指纹图谱构建原则[10]，从12对候选引物中选择扩增片段大小差异大、多态性互补的引物进行组合设计，得到4个引物组，每组引物数量3～5对。其中，组合1由3对引物(HVM68、EBmag0007和Bmac755)构成，组合2由4对引物(Bmag382、Ebmac0415、HVM40和scssr 10148)构成，组合3由4对引物(HVM40、HVM68、scssr 10148和Bmag0007)构成，组合4由5对引物(scssr 07759、scssr10559、BMAG0867、Bmag0120和EBmac 755)构成。以组合1为例，3对引物分别进行单重PCR扩增后的指纹图谱，见图1。

A-引物Bmac775；B-引物HVM68；C-引物EBmag0007图1 加麦Copeland在引物组合1的指纹图谱Fig.1 The fingerprinting of Copeland under combination 1

由图1可知，利用组合1的3对引物分别对Copeland进行扩增。Bmac755扩增后在146 bp处有一个单峰扩增片段(图1-A)；HVM68为双峰特征，分别在223 bp和265 bp处各有一个单峰扩增片段(图1-B)；EBmag0007在253 bp处有单峰扩增片段(图1-C)。引物进行组合设计时不仅要考虑引物多态性、扩增稳定性，还要兼顾后期构建多重PCR反应体系的潜力。

2.3 多重PCR体系构建

为进一步提高检测效率，对4个引物组分别进行多重PCR体系组合试验。在单重PCR扩增的基础上逐渐增加引物，分别进行两重、三重和四重PCR反应。引物进行荧光标记时，扩增片段大小不重合的引物可添加相同荧光标记，扩增片段大小有重合的引物需用不同荧光标记加以区分。通过优化引物浓度、退火温度等条件，优化多重PCR体系，确保多引物在一个PCR体系中扩增效率相同且彼此不干扰。最后，将多重PCR扩增片段与单重PCR扩增片段进行比对，分析片段大小是否一致、有无非特异峰。

结果表明，组合1、组合2和组合3的多重PCR体系均能成功构建，引物组4中存在非特异扩增，可能是引物间存在相互作用所致。进一步对3个引物组的引物数量、扩增效率、组合扩展能力等因素进行综合比较，组合1引物数量最少、扩增一致性好，且组合扩展能力最好。以组合1为例，引物EBmag0007和Bmac755之间扩增片段范围差异在50 bp以上，都用Alexa Fluor 680(绿)荧光标记，3对引物构建的多重PCR反应体系用于品种指纹分析，指纹图谱见图2。

A-Copelang；B-Gairdner图2 引物组合1在麦芽品种Copeland和Gairdner下的多重PCR指纹图谱Fig.2 The multiple PCR fingerprint of combination from varieties of Copeland and Gairdner

图2为组合1对Copeland扩增后的指纹图谱(图2-A)，EBmac755的单峰扩增片段大小为146 bp，HVM68的双峰大小为223/265 bp，Bmag0007的单峰大小为253 bp。Gairdner在组合1扩增下的扩增片段大小分别为140 bp、223/259 bp和267 bp(图2-B)，与Copeland的片段大小完全不同。多重PCR扩增结果与3对引物单独扩增后的片段大小完全一致，无非特异性峰出现。

2.4 品种指纹数据

在选定的24个麦芽品种中，利用毛细管电泳收集引物组合1的三重PCR在群体中的特异性扩增结果，根据不同引物扩增片段大小进行麦芽品种指纹数据库的构建，见表4。

3对核心引物在24个麦芽品种中共得到25个等位基因，每对引物的等位基因6～11个不等，平均产生8.3个等位基因，引物多态性较好。其中，引物HVM68多态性最丰富，在165～299 bp包括11个等位基因，EBmag0007在253～285 bp有8个等位基因，Bmac755在142～160 bp有6个等位基因。

表4 24种麦芽在3对SSR引物下的标准指纹数据Table 4 The standard fingerprint data of 24 varieties of malt at 3 pairs SSR primers

注：-表示无。

2.5 品种区分

将每对引物扩增的等位基因按照从小到大的顺序排列，采用1～9的个位数字和26个英文字母的组合对指纹数据进行编码[17]。按照HVM68、Bmac755和EBmag0007的顺序排列核心引物，引物代码分别编号为1、2、3，等位基因按照从小到大的顺序分别用a、b、c等英文字母编码，组合后就构成了代表各品种身份所特有的标准指纹代码，见表5。

按照核心引物固定的排列顺序，加麦Copeland的标准指纹代码为1h2d3a，澳麦Baudin的标准指纹代码为1a2e3f，品种间差异明显。某些品种在同一引物下等位基因相同，需要结合其他引物才能区分。通过已构建的品种指纹代码，品种区分不仅简单明了，还能确定品种等位基因所处的具体位置。特征等位基因是指在一定品种范围内，某一品种区别与其他所有品种所特有的等位基因[10]。Copeland、Meredith、Sebastian、Planet、Commander、垦16 6个品种各具有1个特征引物，Bow和Vlamingh具有2个特征引物。本研究24个麦芽品种中8个品种有11个特征等位基因，仅用1个特征引物即可鉴别相应的品种。

表5 24种麦芽在3对核心引物上的标准指纹代码Table 5 The SSR standard fingerprint coding of 24 varieties of malt at 3 pairs SSR primers

表6 24种麦芽品种区分的等位基因组合Table 6 The allele-based combination for identification of 24 malt varieties

由表6可知，不同引物彼此组合后在品种区分效率上差异较大。2对引物的组合中，HVM68与EBmag0007组合后可区分13个品种，区分率54.2%；HVM68与Bmac755组合后可区分19个品种，区分率79.2%，说明不同引物的组合之间鉴定效率差异较大。现有引物的等位基因组合中，5种麦芽Metcalfe、Kendall、Latrobe、Compass和Prestige的等位基因相似度较高，需要3对引物才能完全区分，区分难度相对较大。

3 讨论

多年来，麦芽品种混掺已成为麦芽和啤酒行业内的潜规则，给啤酒企业的麦芽采购和啤酒生产带来巨大的经济损失和严重的质量风险。由于掺假麦芽与纯度合格的优质麦芽的市场价格相同，掺假麦芽的获利空间大，那些诚实、合规的企业获利空间越来越小，导致劣币驱逐良币。只有建立一种快速、准确、低成本的麦芽鉴定方法，才能从根本上解决麦芽掺假的行业困局，促进啤酒和麦芽行业更加健康有序的发展。

基于最少引物鉴定最多品种的指纹图谱构建原则[10]，但引物筛选工作量大且繁琐，大部分引物表现存在着缺陷，影响引物的实用性，能筛选出一对综合表现良好、多态性高、重复性好的引物较不易[7]。如冯飞等[26]利用19对条带清晰、多态性稳定的SSR引物构建了122份向日葵材料的SSR指纹图谱，董志刚等[27]利用15对SSR标记建立16份葡萄种质的分子指纹图谱，包温泉等[28]利用9对SSR引物可实现16个仁用杏品种的DNA指纹图谱。本研究对初选的12对多态性引物进行组合设计，得到4个引物组也能实现24个麦芽品种的区分，每组引物数量仅3～5对。

在毛细管电泳多重荧光检测技术应用方面，DANIEL等[29]利用10对SSR引物构建的两个五重PCR扩增体系，对31个加拿大种植的啤酒大麦品种进行区分；夏春兰等[16]认为，与普通荧光检测技术相比多重PCR荧光检测技术的检测效率提高了5.5倍，与聚丙烯酰胺凝胶电泳相比效率提高了11倍。本研究基于3对核心引物构建的多重荧光PCR体系，与单重荧光PCR扩增相比检测效率提高了3倍，电泳检测成本降低75%，结果与上述研究基本一致。

随着品种数量的进一步增加，核心引物组合的区分能力可能会逐渐减低，某些品种的指纹图谱可能完全相同，无法区分。考虑到实际检测中样品数量大、品种亲缘关系相近的问题，权衡准确、快速、经济等要求，可采取“核心引物+扩展引物”的组合模式[30]。在进行麦芽纯度鉴定时，首先选用3对核心引物进行区分，其他9对引物可作为扩展引物，核心引物无法区分时再启用扩展引物。此外，现有的三重PCR体系中仅用到绿色和黑色2种荧光，蓝色荧光标记尚未使用，如有新引物可用蓝色荧光标记，为今后进行四重、五重PCR研究、扩展品种鉴定能力提供了可能。

4 结论

本研究对前期筛选的12对引物进行组合设计，并进行多重PCR体系优化，将3对引物(HVM68、EBmag 0007和Bmac755)确定为核心引物，并对24个麦芽品种进行指纹图谱构建，实现不同麦芽品种的快速区分。与单重PCR需要进行多次毛细管电泳分析相比，多重PCR仅需一次毛细管电泳即可实现全部麦芽品种的同步鉴定，电泳检测时间和成本显著降低，为啤酒企业的大麦、麦芽质量监控提供有效的检测技术。