钱丽洁，黄艳丽，王雄

（上海健康医学院附属第六人民医院东院，上海201306）

到达地面的紫外线主要为长波紫外线（UVA）和中波紫外线（UVB）。UVB主要引起表皮层及真皮浅层的病变，产生日晒红斑、免疫抑制及皮肤癌等疾病状态。在临床，经紫外线晒伤后，给予重组碱性成纤维细胞生长因子治疗，效果较好，王宝玺等[1]发现重组牛碱性成纤维细胞因子对体外培养人永生化角质形成（HaCaT）细胞有促增殖作用。本研究采用体外培养HaCaT细胞，给予UVB照射后造模后，进一步探讨贝复济对光损伤的HaCaT细胞的修复作用的机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料 乳酸脱氢酶（LDH）试剂盒（南京建成），过氧化氢（CAT），试剂盒（南京建成），超氧化物歧化酶（SOD），试剂盒（南京建成），BCA蛋白浓度测定试剂盒（碧云天），CCK-8试剂盒（日本同仁），重组牛碱性成纤维细胞生长因子外用溶液（贝复济，珠海亿胜生物有限公司），HaCaT细胞（上海酶研生物科技有限公司），DMEM（GIBCO公司），胎牛血清（Bovogen公司），0.25%胰蛋白酶（GIBCO公司），PBS（Hyclone公司），紫外线辐照仪（上海西格玛高科技有限公司）酶标仪。

1.2 方法

1.2.1 HaCaT细胞培养 HaCaT细胞培养在含10%FBS+DMEM培养液中，置于5%CO2、37℃培养箱，取3～8代对数生长期细胞用来做本次实验。

1.2.2 建立细胞光老化模型 参考相关文献建立细胞光老化模型的方法[2-4]。具体操作流程为UVB照射前1天对细胞进行传代，使其汇合度为50%～70%。照射前将培养液吸去，磷酸盐缓冲液（PBS）冲洗1次，再加入少量PBS覆盖照射细胞上层，以UVB光源照射，剂量为10、20、30 mJ/cm2。正常组细胞不经UVB照射处理，作为对照。照射完后，吸弃PBS，加入培养液继续培养24 h，获细胞培养上清或细胞，用于后续实验。

1.2.3 CCK-8检测 将HaCaT细胞以5×104个/孔接种于96孔板，待细胞贴壁后，模型组及给药组按1.2.2方法造模，对照组按常规培养。造模后各组给予培养液100 μL，细胞培养24 h后，每孔加入CCK-8溶液10 μL，置于37℃，5%CO2培养箱中避光孵育；孵育4 h后。在酶标仪上于450 nm波长处测定各孔的吸光度值。实验均重复3次，每样本设3个复孔，结果取平均值；计算细胞存活率=A加药-A空白/A对照-A空白。

1.2.4 SOD活性、CAT及LDH含量检测 HaCaT细胞以1×106个/孔接种六孔板，建NB-UVB诱导细胞老化模型，每组设3个复孔，将细胞分为空白组、贝复济组、10 mJ/cm2UVB组+贝复济组、20 mJ/cm2UVB组+贝复济组、30 mJ/cm2UVB组+贝复济组共5组，每组4个。根据分组相应加入贝复济后。细胞培养24 h后，收集上清液检测LDH含量，收集细胞检测SOD和CAT含量。实验重复3次，每样本设3个复孔。

1.3 统计学分析 采用SPSS 21.0软件对实验数据进行单因素方差分析进行两两比较统计分析，实验结果以表示，各组间进行t检验或单因素方差分析，P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

通过UVB照射后，检测HaCat细胞后增殖活性，结果显示随着10 mJ/cm2、20 mJ/cm2及30 mJ/cm2能力，发现随着照射能量越强，HaCaT细胞后增殖活性越越低，同时，贝复济对HaCaT细胞后增殖活性保护作用也越强，见表1。

表1 贝复济对UVB照射HacaT细胞后增殖活性的影响 （±s，n=4）

表1 贝复济对UVB照射HacaT细胞后增殖活性的影响 （±s，n=4）

注：与对照组相比，*P＜0.01，**P＜0.01，***P＜0.01。

组别 0对照组 1贝复济组 1 10*0.843±0.010 0.902±0.171 20**0.735±0.216 0.860±0.028 30***0.630±0.212 0.723±0.014

利用单因素方差分析进行两两比较，见表2。

表2 贝复济（下表贝复济简称为药）对HaCaT细胞SOD活性、CAT及LDH含量的影响 （±s，n=4）

表2 贝复济（下表贝复济简称为药）对HaCaT细胞SOD活性、CAT及LDH含量的影响 （±s，n=4）

组别 SOD值 CAT含量 LDH含量空白对照组 8.365±0.865 102.160±0.459 634.510±21.661加药对照组 8.740±0.103 120.179±8.879 639.584±16.264 10 mJ/cm2无药组 7.243±0.083 86.530±0.942 836.982±10.159 10 mJ/cm2加药组 8.619±0.111 96.164±2.812 740.125±15.925 20 mJ/cm2无药组 6.636±0.056 69.881±0.729 983.140±9.960 20 mJ/cm2加药组 8.321±0.111 77.896±1.395 834.664±17.893 30 mJ/cm2无药组 5.957±0.034 51.000±0.770 1 311.276±29.377 30 mJ/cm2加药组 8.184±0.131 62.912±1.041 1 013.985±69.337

贝复济组与空白组及不同照射能量贝复济组比较，以及不同能量贝复济组之间两两比较：SOD值中除了加药对照组与10 mJ/cm2加药组相比P＞0.05、20 mJ/cm2加药组与30 mJ/cm2加药组相比P＞0.05。CAT含量中除了10 mJ/cm2加药组与20 mJ/cm2加药组相比P＞0.05；LDH含量中除了加药组与空白组比P＞0.05外，其余两两相比均P＜0.05。

不同能量照射组之间，以及和各个能量照射加药组两两比较：10 mJ/cm2细胞组与20 mJ/cm2细胞组、30 mJ/cm2细胞组相比P＜0.05，20 mJ/cm2细胞组与 30 mJ/cm2细胞组相比P＜0.05；10 mJ/cm2细胞组与 10 mJ/cm2加药组相比P＜0.05，20 mJ/cm2细胞组与 20 mJ/cm2加药组相比P＜0.05；30 mJ/cm2细胞组与30 mJ/cm2加药组组相比P＜0.05。

以上结果发现随着UVB的剂量增大，对HaCaT细胞损伤增强，贝复济对紫外线损伤有修复作用。

3 讨论

光老化是指紫外线被细胞中DNA和蛋白质吸收引起DNA损伤及下游信号通路的活化，引起异常的细胞因子并改变基因表达，引起皮肤光老化，后者主要表现为皮肤粗糙，皱纹加深，色素沉淀和皮肤松弛[5-6]。角质形成细胞位于皮肤的表皮层，是抵抗紫外线照射的第一道防线，其中角质形成细胞是UVB作用的主要靶部位。众所周知，重组碱性成纤维生长因子在体内分布广泛，并且有广泛的生物效应，对成纤维细胞、KC以及成骨细胞等均有增生作用，其对来源于中胚层和外胚层的细胞有促进修复和再生作用，能促进毛细血管再生，改善局部血液循环，加速创面的愈合[7]，但对于紫外线引起的光损伤的修复作用目前很少研究。

王宝玺等[1]发现重组牛碱性成纤维细胞因子对体外培养人角质形成细胞有促增殖作用。同时，众所周知UVB主要作用于表皮，使角质形成细胞产生大量ROS，诱发氧化反应，导致SOD等抗氧化酶含量下降，终产物丙二醛、LDH含量增加，导致更多ROS的产生，加剧皮肤组织和细胞的损伤。目前，多数文献显示评价皮肤光老化的客观标准均通过测定 SOD、LDH、CAT、GSH等含量和 MDA水平是否存在差异[8-9]。

本文选定UVB作用于HaCaT细胞建立光老化模型。结果：一方面通过UVB照射后，检测HaCaT细胞后增殖活性，结果显示，随着10 mJ/cm2、20 mJ/cm2及30 mJ/cm2剂量增加，HaCaT细胞后增殖活性越越低，同时，贝复济对HaCaT细胞后增殖活性保护作用也越强。另一方面：发现贝复济组与空白组及不同照射能量贝复济组比较，以及不同能量贝复济组的SOD活性、CAT及LDH含量之间两两比较结果，随着UVB的剂量增大，对HaCaT细胞损伤增强，但加入贝复济后细胞的SOD活性、CAT及LDH含量与相应的对照组比较差异有统计学意义，说明贝复济对紫外线损伤后的细胞有修复作用。