王雄 ，姚春海 ，刘青云 ，陈少君 ，宋艳丽

（1.北京市密云区中医医院，北京101500；2.中国中医科学院西苑医院，北京100091）

特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一种与遗传相关的，常伴有过敏性鼻炎或哮喘的慢性、复发性、炎症性皮肤病。皮肤屏障功能的受损与病原微生物的定植，是AD发病的一个重要因素。这些病原微生物常常可以诱发或加重AD，但其发病机制不详。

Toll样受体（Toll like reeeptor，TLR）是一类跨膜受体，通过识别并结合相应的配体启动信号转导途径，激活核转录因子（Nuclear factor，NF）κB 而介导天然免疫和获得性免疫。其中TLR-2和TLR-4是激活NF-κB的重要信号受体。NF-κB是普遍存在于哺乳动物细胞中的一种转录调控因子，能和多种与细胞免疫相关的基因启动子的κB序列结合，发挥核转录因子作用，其中p65亚基是其发挥转录激活功能的主要成分。

龙牡汤（生龙骨30 g、煅牡蛎30 g、骨碎补10 g、地肤子30 g、连翘15 g、地肤子30 g）是西苑医院黄尧洲主任医师在临床工作中总结出的治疗AD的经验方。笔者课题组前期研究发现龙牡汤治疗AD有较好的临床疗效（有效率83.4%[1]），明显改善患者的临床症状，减少复发，提高生活质量，无明显不良反应，同时可降低AD患者血清中IgE的表达。本研究就TLR-4和NF-κB p65在龙牡汤干预AD小鼠模型的前后，检测皮损中的蛋白表达量，结合炎症因子的变化，分析其相关性，探讨龙牡汤发挥作用的免疫学机制。

1 材料与方法

1.1 实验材料

1.1.1 实验动物 清洁级BALB/c小鼠18只，雄性，6周龄，体质量18～22 g，购于北京维通利华实验动物技术有限公司，批号：11401500010005。在中国中医科学院西苑医院动物实验中心[许可证号：SCXK（京）2016-0002]SPF级动物房饲养，室内温度（25±2）℃，相对湿度控制在 50%～60%，昼夜时间控制在各12 h，自由进食与饮水。所有实验遵循国家有关实验动物的使用、福利和伦理学要求等项规定。

1.1.2 实验试剂 丙酮、2，4-二硝基氯苯（DNCB）（北京奥博特生物技术公司，Lot：20161102）；小鼠血清IgE、白细胞介素（IL）-4、干扰素（IFN）-γ 的 ELISA试剂盒（南京建成生物技术有限公司，Lot：05/2017）；鼠抗人TLR-4单克隆抗体（美国Abnova公司），鼠抗人NF-κBp65单克隆抗体（美国SantaCruz公司），DAB显色试剂盒、SP免疫组化盒（北京中杉金桥生物技术有限公司）。

1.1.3 主要仪器 酶标仪（德国Thermo公司），NBS超低温冰箱，游标卡尺（上海精密公司），离心机（德国Sartorius公司），普通光学显微镜（日本OLMPUS公司），TB-718生物组织包埋机（日本樱花公司），Leica RM2235组织切片机、Leica ST5020徕卡全自动组织脱水机、Leica HI1220烤片机（德国莱卡公司），Olympus BX-51显微镜（美国奥林帕斯公司），Anymicro DSSTM图像采集系统（江苏琅珈科技有限公司）。

1.2 实验方法

1.2.1 分组和造模 将18只小鼠按随机数字法分成模型组、中药组和空白组，每组各6只。其中将模型组、中药组12只小鼠制作AD模型。造模方法采用DNCB外涂法造模[2]。

1.2.2 药物干预并取材 中药组给予龙牡汤灌胃，根据体质量，按0.1 mL/10 g给药。同样方法，模型组和空白组给予浓度0.9%的生理盐水灌胃。1次/d，连续灌胃3周。末次给药后，24 h内处死并取材（局部皮损及摘眼球取血）。皮肤组织做病理切片对比并给予免疫组化染色，外周血取血清并做酶联免疫吸附测定（ELISA）。

1.2.3 免疫组化 TLR-4阳性表达定位于细胞胞膜和/或胞质，呈黄色或棕黄色染色；NF-κB p65阳性表达定位于细胞质和细胞核，呈黄色或棕黄色颗粒。着色程度以阳性细胞所占的百分比来表现。具体计分方法如下：高倍镜下拍摄3个视野，将采集的图像应用Image-pro Plus 5.1图像分析系统进行分析，所得数据作免疫组织化学染色阳性信号累积光密度（IOD），以IOD值作为组织表达的定量标准。累积光密度（IOD）=平均光密度（AOD）×阳性面积（A）。

1.3 统计学分析 应用SPSS 20.0统计软件进行数据统计分析：变量间差异的比较采用非参数等级资料秩和检验（Mann-whitney检验）；各项指标间的相关关系采用Spearman相关分析；计数资料采用两样本均数比较的t检验；多组指标的关联性分析采用偏相关性分析为差异有统计学意义（P＜0.05）。

2 结果

2.1 皮损组织病理学改变 空白组：鳞状上皮未见增生，真皮层如常；模型组：鳞状上皮增生明显，局部呈乳头状增生，真皮层内多量炎细胞浸润，血管扩张、充血；中药组：较模型组，炎症细胞浸润减少，见图1。

2.2 血清学指标变化 经过3周给药干预后，经LSD检验，与中药组和空白组比较，模型组的IgE、IL-4水平表达均明显增高，差异分析有统计学意义，而中药组与空白组比较，差异无统计学意义。血清中IFN-γ，各组数值方差不齐，经Welch检验，3组分析无统计学意义，见表1、图2。

2.3 TLR-4、NF-κB p65在AD模型组和对照组的表达情况 TLR-4在模型组有强烈表达，中药干预组，明显减少，证明了龙牡汤的药效以及可能的作用靶点，空白组阴性表达，差异有统计学意义。见表2，图 3、5。

图1 小鼠背部皮肤组织病理（HE染色×200）

表1 干预后小鼠血清学指标变化 （±s）

表1 干预后小鼠血清学指标变化 （±s）

注：与中药组、模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01。

组别 IgE（pg/mL） IL-4（pg/mL） IFN-γ（pg/mL）中药组 1.24±0.17* 6.27±0.14** 31.58±2.60模型组 1.46±0.12 6.96±0.61 37.29±5.20空白组 1.26±0.07* 6.29±0.09** 30.41±0.43

图2 干预后小鼠血清炎症因子变化

表2 TLR-4和NF-κB P65蛋白表达的变化 （±s）

表2 TLR-4和NF-κB P65蛋白表达的变化 （±s）

组别 n TLR-4 NF-κB p65空白组 6 1 552.2±134.88 1 563.20±148.26模型组 6 2 356.8±181.40 2 402.88±223.07中药组 6 2 052.7±163.51 1 935.07±198.46

图3 小鼠背部皮肤免疫组化（TLR-4 SP 染色×200）

图4 小鼠背部皮肤免疫组化（NF-κB SP 染色×200）

图5 3组小鼠背部皮损中TLR-4、NF-κB p65蛋白表达情况

NF-κB p65在模型组有显著表达，中药组次之，空白组最少，差异有统计学意义。见表2，图4、5。

结果统计分析

TLR-4：经LSD检验，3组间差别有统计学意义（P＜0.05），其中模型组最高，中药组其次，空白组最小。

NF-κB p65：经LSD检验，3组间差异有统计学意义（P＜0.05），其中模型组最高，中药组其次，空白组最小。

2.4 AD模型小鼠皮损中TLR-4和NF-κB p65蛋白共表达结果及关系 在12例AD模型小鼠的皮损病理中，有8例小鼠的TLR-4和NF-κB p65同时表达为阳性，3例同时呈阴性表达，1例呈TLR阳性而NF-κB p65呈阴性表达。利用Spearman相关分析：TLR-4和NF-κB p65的表达呈正相关（r=0.618，P＜0.05）。

2.5 皮损中TLR-4和NF-κB p65蛋白与炎症因子的相关性分析 将AD模型小鼠的血清学炎症因子指标（IgE、IL-4、IFN-γ）与皮肤病理免疫组化染色指标（TLR-4、NF-κB p65）相结合，分析炎症因子分别与TLR-4、NF-κB的相关性，采用偏相关性分析方法，发现外周血清炎症因子与TLR-4、NF-κB p65呈正相关，统计情况见表3。

表3 小鼠炎症因子与免疫组化指标结果统计 （±s）

表3 小鼠炎症因子与免疫组化指标结果统计 （±s）

分组 IgE（ng/mL）IL-4（pg/mL）IFN-γ（pg/mL） TLR-4 NF-κB p65中药组 1.24±0.17 6.27±0.14 31.58±2.60 2 053.7±164.1 1 935.1±198.5模型组 1.46±0.12 6.96±0.61 37.29±5.20 2 356.8±181.4 2 402.9±223.1空白组 1.26±0.07 6.29±0.09 30.41±0.43 1 552.2±134.9 1 563.2±148.3

结果统计分析：IL-4与 TLR-4、NF-κB p65 呈正相关（P＜0.05），相关系数分别是：0.485、0.569；IgE与 TLR-4、NF-κB p65呈正相关（P＜0.05），相关系数分别是：0.651、0.721；IFN-γ 与 TLR-4、NF-κB p65呈正相关（P＜0.05），相关 系数分别是：0.55、0.634。

3 讨论

AD的发病机制尚未完全清楚，角质形成细胞不但是皮肤的重要屏障结构细胞，而且也参与皮肤组织免疫反应。当皮肤受到损伤或外源性刺激时，角质形成细胞分泌多种生物活性分子参与皮肤组织的天然免疫反应。目前研究热点主要集中于皮肤屏障与免疫功能异常，皮肤屏障缺陷使外界抗原更容易透过皮肤，与抗原提呈细胞相互作用并诱发级联免疫反应，这些炎症反应又会反过来导致皮肤屏障功能失衡，加重病情[3]。

TLR是一种广泛表达于哺乳动物细胞表面的跨膜信号传导受体。其可以识别多种病原相关分子模式及一些内源性配体，激活NF-κB，导致大量细胞因子的表达，介导机体炎症免疫反应及细胞的生长和分化。TLR作为连接天然免疫和获得性免疫的桥梁，参与AD的发病。因此，对TLR与AD关系的研究有助于进一步阐明AD的发病机制，有助于提出新的基于TLR的治疗策略[4]。

TLR-4是一种分布广泛的重要模式识别受体，可调控诸多免疫、炎症性疾病发病过程的信号转导[5]。NF-κB是普遍存在于哺乳动物细胞中的一种转录调控因子，能和多种与细胞免疫相关的基因启动子的κB序列结合，发挥核转录因子作用，其中p65亚基是其发挥转录激活功能的主要成分[6]。多种免疫分子的释放均依赖于TLR-4诱导的NF-κB p65通路激活，即NF-κB p65的触发是TLR-4调控免疫反应的中枢环节[7，9]。TLR-4已经成为近年来研究的热点，诸多慢性炎症、免疫抑制类疾病都与此相关，有望成为此类疾病的治疗靶点。Kim等[8]研究发现：革兰染色阴性菌细胞外壁的主要成分是脂多糖（LPS），其可以刺激皮肤的角质形成细胞（KC），引发TLR-4及其介导的NF-κB通路的激活，从而导致皮肤的炎症反应。本研究发现，皮肤病理组织中TLR-4和NF-κB p65都存在高表达，通过Spearman相关性分析，发现二者呈正相关关系，说明二者存在通路上的相关性。再结合血清学中炎症因子的表达与皮损中SP免疫组化结果，通过偏相关分析发现：TLR-4和NF-κB p65与血清学炎症因子IgE、IL-4和 IFN-γ呈正相关性（P＜0.05），推测可能是外界因素刺激角质形成细胞过度表达，与TLR-4相结合，激活核因子通路，介导炎症因子的释放，引起皮炎的发生。通过中药龙牡汤的干预，发现TLR-4的表达有所下降，因此笔者推测龙牡汤可能是通过影响TLR-4/NF-κB p65信号转导通路，从而调整炎症因子的表达，调节了Th1/Th2细胞亚群，使失衡的免疫状态重新得到平衡，而起到良好的治疗作用，但参与这条通路的具体机制尚未明确，仍有待于进一步研究。