王砚砚,朴莲淑,杨子荣,张 孟,于庆功

(大连大学附属中山医院 消化内科,辽宁 大连116001)

肝细胞癌(HCC)是最常见的恶性肿瘤之一,流行病学调查显示,全球范围内其发病率居常见恶性肿瘤第5位,病死率第3位[1]。因其早期症状隐匿,进展迅速,恶性程度高,大多数患者确诊时已处于中晚期,同时大多伴有局部浸润或远处转移,往往预后不佳。因此,深入探讨肝癌发生发展机制,寻找肝细胞癌恶性增殖及转移治疗干预靶点已成为近期研究热点。14-3-3蛋白家族为高度保守性蛋白,参与各种恶性肿瘤的发生、发展,本研究采用免疫组织化学法检测HCC癌组织和癌旁组织14-3-3 zeta蛋白表达情况,并对其与肿瘤临床病理特征进行初步探讨。

1 资料与方法

1.1 临床资料选取2012年1月至2018年12月在大连大学附属中山医院诊治的手术后肝细胞肝癌组织标本72例,其中男47例,女25例,年龄37-73岁,平均52岁。所有患者诊断标准均参考《原发性肝癌诊疗规范(2017年版)》的标准。排除标准：(1)术前有化疗、放疗以及免疫治疗者；(2)未经病理学检查证实的患者；(3)继发性肝癌；(4)合并有其他器官恶性肿瘤；(5)伴有免疫系统疾病。

1.2 肝组织14-3-3 zeta蛋白检测应用免疫组织化学染色法,将所有组织标本(包含肿瘤组织和癌旁组织)经石蜡包埋后作连续切片,厚度约为5 μm。将兔抗人14-3-3 zeta 多克隆抗体(Abcam公司,英国)稀释度为1∶200,作为一抗,染色试剂盒为中杉金桥超敏型PV-9000试剂盒,按试剂说明书进行。

1.3 结果的判定兼顾肿瘤阳性细胞百分率和肿瘤阳性细胞染色强度,对免疫组织化学染色结果进行判定。肿瘤阳性细胞百分率评分:0分(<5%)、1分(5%-25%)、2分(26%-50%)、3分(51%-75%)、4分(>75%)。染色强度评分：0分(无染色),1分(轻度染色,即浅黄色),2分(中度染色,即棕黄色),3分(强染色,即黄褐色)；免疫组化评分=肿瘤阳性细胞百分率×染色强度。对免疫组化染色进行评分：0-0.5分计为0分,0.5-1.5分计为1分,1.5-2.5分计为2分,>2.5分计为3分,并且：0分(-),1分(+),2分(++),3分(+++)；(-)和(+)为阴性,(++)和(+++)为阳性。

1.4 统计学分析采用SPSS 19.0软件进行统计分析。计量资料以均数±标准差表示,两组间比较采用t检验；计数资料以例数和百分比表示,组间比较采用χ2检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 肝细胞癌患者肝组织14-3-3 zeta 蛋白表达情况经免疫组织化学染色后,14-3-3 zeta蛋白在HCC组织和癌旁组织中均有表达,且HCC组织(61.1%,44/72)中表达的阳性率显著高于癌旁组织(12.5%,9/72),差异具有统计学意义(χ2=34.51,P=0.00)，如图1。

注：A为癌组织；B为癌旁组织

2.2 14-3-3 zeta 蛋白表达阳性率与肿瘤临床病理特征如表1所显示,14-3-3 zeta 蛋白在肿瘤组织学分级Ⅲ级和Ⅳ级、术前AFP >400 ng/ml、发生血管浸润的癌组织中表达阳性率分别为80.0%、79.5%、82.6%,显著高于组织学分级Ⅰ级和Ⅱ级、术前AFP≤400 ng/ml以及未发生血管浸润的癌组织(53.1%、48.5%、55.1%),两组比较差异均具有统计学意义(P<0.05)；其表达水平与有无包膜、病灶大小无相关性。

3 讨论

14-3-3蛋白家族是一个高度保守的酸性多肽家族,其过表达有助于各种恶性肿瘤的发生、发展。该蛋白家族中重要成员之一14-3-3 zeta,主要以同源/异源二聚体形式存在,参与调节细胞周期、有丝分裂、凋亡和侵袭等多个细胞过程[2]。既往研究中已经被证实其在食管癌、乳腺癌中表达显著升高。同时,本实验也通过对免疫组织化学染色结果进行分析,HCC患者癌组织中14-3-3 zeta蛋白的表达阳性率明显上升,显著高于癌旁肝组织,差异较为明显,提示14-3-3 zeta蛋白的高表达均能够影响到HCC 的发生过程。有研究者认为,14-3-3 zeta在通过激活JNK和p38/MAPK信号通路调控HCC细胞增殖,降低14-3-3 zeta 表达可以提高化疗敏感性[3]。同时,14-3-3 zeta在肝癌细胞凋亡中也扮演重要角色。过表达的14-3-3 zeta与ASK1特异位点结合并相互作用,抑制了ASK1介导的肝细胞凋亡。若阻断二者的特异结合,则可增强ASK1介导的肝癌细胞凋亡[4]。

表1 癌组织14-3-3 zeta 蛋白表达阳性率(%)与肿瘤临床病理特征分析

唐裕福[5]等研究发现,14-3-3 zeta的表达与肿瘤大小、卫星灶、微血管侵袭、门静脉癌栓、远处转移、早期复发及肿瘤TNM分期等恶性病理特征密切相关,提示14-3-3 zeta可能与肝癌的转移密切相关。在本研究中,对比不同的临床病理学特征分析发现,癌组织14-3-3 zeta蛋白在组织学分级较差、合并血管浸润以及术前血清AFP水平较高的HCC患者中表达阳性率明显上调。复习相关研究认为：(1)肝癌细胞中14-3-3 zeta上调E-cadherin的转录抑制因子snail和tiwst的表达,抑制了E-cadherin的表达,即通过调控上皮间质化(EMT)的进程来促进肝癌细胞的转移,与肿瘤分化程度、肿瘤淋巴结转移及TNM分期密切相关[6]。(2)14-3-3 zeta 表达增加与术前血清AFP升高在辅助诊断原发性肝癌中具有一致性,提示14-3-3 zeta将可能成为未来早期诊断和筛查肝细胞性肝癌的新生标志物[7]。(3)在肿瘤细胞的侵袭过程中,肿瘤周围基质的降解由金属基质酶(MMPs)调控,血管的生成则由血管内皮生成因子(VEGF)调控,而14-3-3 zeta 调控着二者的表达。但本研究并未发现 14-3-3 zeta蛋白的表达与肝癌组织包膜浸润及肿瘤病灶大小的关系,这与王恺等的研究结果不一致,分析其原因可能14-3-3 zeta主要参与肝癌免疫反应有关[8,9]。

14-3-3蛋白可与多种蛋白结合,参与了细胞内广泛的生物学事件调控过程,探索14-3-3 zeta在恶性肿瘤中的凋亡调控作用,有望为肝细胞癌的生物学治疗提供新的思路[10]。