刘晓峰，石玉星，赵晓军，蔡 瑾，张宝俊，任 璐

（1.山西农业大学农学院，山西太谷030801；2.山西省农业科学院植物保护研究所，山西太原030031；3.山西大学应用化学研究所，山西太原030006）

植物内生细菌（Plant endophytic bacteria）作为生活在宿主植物体内而不引起明显症状的一类特殊微生物，普遍存在于各种植物中，对植物生长发育和抗逆性提高具有重要作用，近年来备受人们关注[1-3]。目前，人们已从经济作物[4-5]、粮食作物[6]、中药材[7-9]和杂草[10]等多种植物体内分离和筛选到具有促生和抗病作用的内生细菌，说明植物内生细菌在促进植物生长发育和植物病害生物防治[11]中具有重要意义。此外，防御酶作为提高植物抗逆性的关键酶，已有研究发现，超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化物酶（POD）、过氧化氢酶（CAT）和丙二醛（MDA）同植物的抗旱、耐盐和抗病性有关[12-15]；苯丙氨酸氧化酶（PAL）和多酚氧化酶（PPO）同植物抗病性关系密切[16]；而且有报道显示，植物内生细菌对宿主植物体内防御酶活性有重要影响[17-19]。有关植物内生细菌对宿主植物体内防御酶活性的影响研究对进一步明确其促生和抗病机制具有重要意义。

谷子（Setaria italica）属禾本科黍族狗尾草属，是我国北方地区主要粮食作物之一，其具有耐旱、耐瘠和耐贮存等特点，对旱作农业发展具有重要意义[20-21]。随着人们对有机食品观念的加深，有机谷子生产成为目前谷子产业发展的一个重要趋势[22-23]。因此，减少化肥和化学农药使用量，开展谷子有机肥、病虫害生物防治以及生物菌肥等研究和应用成为谷子有机产业的重要推动力。

本研究以山西农业大学农学院蔬菜病害防治课题组前期筛选出的对谷子白发病菌和谷瘟病菌有良好抑制作用的曼陀罗内生细菌MY1 为研究对象，通过测定其发酵液对谷子幼苗生长及防御酶活性的影响，旨在明确内生细菌MY1 对谷子的抗病促生作用，为谷子生产过程中“肥药双减”以及有机谷子生产技术的开发提供理论依据。

1 材料和方法

1.1 供试材料

供试谷子品种为晋谷21 号。

1.2 供试菌株与培养基

曼陀罗内生细菌MY1 分离自植物曼陀罗叶片组织；采用甘油冷冻保藏法，保存于山西农业大学植物化学保护实验室。

NA 培养基：蛋白胨10 g，牛肉膏3 g，NaCl 5 g，琼脂20 g，pH 值7.0，定容至1 000 mL。

LB 培养液：蛋白胨10 g，酵母粉5 g，NaCl 10 g，pH 值7.0，定容至1 000 mL。

1.3 试验方法

1.3.1 MY1 菌株发酵液对谷子幼苗促生作用的影响

1.3.1.1 种子液的制备 将保存的MY1 菌株在NA 平板上活化24 h 后，接种于LB 培养液中，于28 ℃、160 r/min 振荡培养24 h 后得到种子液。

1.3.1.2 发酵液的制备 将MY1 菌株种子液按1%（V/V）的接种量接入LB 培养液中，于28 ℃、160 r/min 振荡培养72 h，于4 ℃、12 000 r/min 离心10 min，经0.22 μm 微孔滤膜过滤后，即得到MY1菌株的发酵液，保存于4 ℃备用。

1.3.1.3 促生作用测定 取晋谷21 号种子，过筛去除秕谷后，选取大小均匀饱满的种子，先后浸于1%NaClO 和75%乙醇中进行表面消毒，并用无菌水冲洗3 次后，进行播种；待幼苗长出第4 片真叶时，选取长势大小一致的幼苗留苗，并分别用MY1 发酵液原液、5倍、10倍、20倍、50倍、80倍、100倍稀释的发酵液进行灌根，每盆20 mL，5 d 后再次灌根，同时以等量清水作为对照，室温培养，适时适量浇水，播种60 d 后测量株高、根长、鲜质量和干质量。

1.3.2 MY1 菌株发酵液对谷子防御酶活性的影响

1.3.2.1 样品采集 以1.3.1 的方法播种晋谷21 号以及施用MY1 菌株发酵液，于处理10 d 后采用5 点法随机取样，采集各个处理谷子叶片20 g，置于-20 ℃冰箱保存备用。

1.3.2.2 组织匀浆的制备 准确称取谷子叶片组织，放入预冷的研钵中，按比例加入匀浆介质（生理盐水或0.1 mol/L pH 值7.0～7.4 磷酸盐缓冲液），冰水浴条件下，充分研磨成匀浆，制备10%的匀浆液，于4 ℃、4 000 r/min 离心10 min，收集上清液即酶提取液，低温保存备用；将取得的上清液根据不同组织，再用匀浆介质稀释成不同浓度，进行最佳取样量预试验。确定最佳取样量后再进行正式试验。

1.3.2.3 酶活性的测定方法 CAT、MDA、PAL、POD、PPO、SOD 酶活性测定均参照试剂盒操作步骤进行，试剂盒购于南京建成生物工程研究所。

1.4 数据统计分析

所有试验数据均通过Excel 2010 进行整理和作图，数据方差分析均采用SPSS 17.0 进行。

2 结果与分析

2.1 MY1 菌株发酵液对谷子幼苗促生作用的影响

由图1、图2 可知，株高、根长、鲜质量及干质量均随着MY1 菌株发酵液稀释倍数的增大而呈现先升高后下降的变化趋势，且以稀释20 倍效果最好，幼苗株高、根长、鲜质量、干质量分别比对照显著增加了30.15%，36.84%，20.25%和42.11%。当发酵液稀释倍数大于80 倍或小于10 倍时无促生效果；而当稀释倍数为10～80 时表现出不同程度的促生效果，说明MY1 菌株发酵液在一定低浓度下对谷子生长发育具有一定的促进作用，而高浓度时，则有一定的抑制作用。

2.2 MY1 菌株发酵液对过氧化氢酶（CAT）活性的影响

不同处理条件下，谷子叶片的CAT 活性如图3所示，MY1 菌株发酵液在稀释5 倍和100倍后可显著提高谷子叶片的CAT 活性，且以稀释100 倍效果最好，酶活性可达6.12 U/mg，但在促生效果较好的20倍稀释液下该酶活性较低。

2.3 MY1 菌株发酵液对丙二醛（MDA）含量的影响

不同处理条件下，谷子叶片的MDA 含量如图4所示，除了100倍发酵液处理叶片的MDA 含量与对照无显著差异外，其他稀释浓度的MY1 发酵液处理过的谷子叶片MDA 含量均显著低于对照，且以20 倍稀释液下谷子幼苗叶片中的MDA 含量最低，说明MY1 发酵液稀释20 倍后对谷子植株的膜系统保持稳定，抗逆性增强，对减少植物病害的发生具有明显促进作用。

2.4 MY1 菌株发酵液对苯丙氨酸解氨酶（PAL）活性的影响

不同处理条件下，谷子叶片的PAL 活性如图5所示，10倍菌株发酵液处理叶片的PAL 活性显著高于其他处理，酶活性可达70.18 U/g；5倍、20倍、80倍的MY1 发酵液处理过的谷子叶片的PAL 活性也显著高于对照。说明5倍～80倍的MY1 菌株发酵液可以使谷子植株的抗病性增强，而发酵液原液处理的PAL 活性与对照间无显著差异，说明菌株发酵液浓度过高反而会对植物抗逆性产生一定抑制作用。

2.5 MY1 菌株发酵液对过氧化物酶（POD）活性的影响

不同处理条件下，谷子叶片的POD 活性如图6所示，谷子幼苗经MY1 不同稀释倍数发酵液处理后，只有稀释10 倍发酵液处理的谷子叶片POD 活性显著高于对照，其他浓度处理与对照间均无显著差异。

2.6 MY1 菌株发酵液对多酚氧化酶（PPO）活性的影响

不同处理条件下，谷子叶片的PPO 活性如图7所示，谷子幼苗经菌株MY1 发酵液的5 倍、10 倍和80 倍稀释液进行灌根处理后，同对照相比可显著提高谷子叶片中的PPO 活性。

2.7 MY1 菌株发酵液对超氧化物歧化酶（SOD）活性的影响

不同处理条件下，谷子叶片的总SOD 活性如图8 所示，发酵液原液处理过的谷子叶片的SOD活性显著高于清水对照处理，其余浓度处理的谷子SOD 活性与对照间无显著差异或显著低于对照。

3 结论与讨论

目前，发现一些植物内生细菌不仅具有良好的抑菌特性，还具有较好的促生作用[24]，随着研究和认识的不断深入，植物内生细菌同宿主之间互作关系的研究成为近年来的热点。本研究探讨了曼陀罗内生细菌MY1 对谷子幼苗的促生作用，并对MY1菌株发酵液作用下谷子体内防御酶活性的变化进行了探究，结果表明，谷子幼苗株高、根长、鲜质量和干质量均随着发酵液稀释倍数的增大而呈现先升高后下降的趋势，其中以20 倍稀释液效果最好。这与张艳丽[23]和曹玉欣[25]的研究结果相似。进一步说明，MY1 不仅具有生防微生物较好的抗病性，而且还具有一定的促生特性，在谷子促生防病中的应用潜力明显。

内生细菌MY1 对谷子幼苗体内防御酶活性的测定结果表明，不同稀释倍数对不同防御酶活性的影响存在一定差异，且整体以10～20 倍稀释液提高谷子幼苗防御酶活性效果最好，说明菌株MY1 发酵液可提高谷子植株中的保护酶活性，从而提高植株的抗逆能力。仇艳肖[26]研究发现，拮抗菌ch2-22发酵液稀释50～100 倍可明显提高黄瓜幼苗体内的防御酶活性；高振峰[27]研究发现，菌株ZSYB-1 发酵液稀释10 倍后可明显提高番茄体内防御酶活性；戴秀华等[28]研究发现，解淀粉芽孢杆菌Lx-11发酵液稀释100 倍后可明显提高水稻体内防御酶活性；张艳丽[23]研究发现，菌株LCO 和Th-17 菌悬液可提高谷子防御酶活性。本研究结果与上述报道结果存在一定的差异，可能与菌株来源不同以及菌株在提高互作植物防御酶活性方面存在一定差异有关。

另外，虽然谷子幼苗经适当稀释后的MY1 菌株发酵液处理后其体内的防御酶活性呈现出一定的提升效果，但对各防御酶提升效果进行对比分析发现，MY1 菌株发酵液对提高PAL 酶活性和降低体内MDA 含量最为明显，说明该菌株发酵液的抗病促生机制可能为提升PAL 酶活性和降低MDA含量。相关大田试验以及促生活性物质的鉴定还有待后续进一步研究。