袁林， 贾化可， 盛淼淼， 王兵， 曾丽娜， 刘红美，隆耀航**

(1.贵州医科大学 医药生物技术研究中心,贵州 贵阳 550025； 2.贵州医科大学 生物与医学工程重点实验室,贵州 贵阳 550025；3.贵州省教育厅 免疫细胞与抗体工程研究中心,贵州 贵阳 550025； 4.贵州医科大学 生物与工程学院， 贵州 贵阳 550025)

在微生物生命活动中，铁元素参与多种生化代谢过程。铁在地壳中含量较多，但多以Fe(OH)3形式存在，溶解性差，很难被生物吸收利用[1-2]，因此微生物进化过程中形成了多种途径来获取铁，合成嗜铁素(Siderophore)就是其中一种非常重要的途径[3-6]。嗜铁素是微生物在低铁或缺铁应激条件下合成的一种能够高效结合Fe3+、并将其转运到细胞内的小分子有机化合物[7]。短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)是革兰阳性菌，有较强蛋白分泌能力，是一种产芽孢的生物防治菌[8-12]。短短芽孢杆菌GZDF3从半夏根际土壤分离获得[13]，该菌株对半夏病原菌及多种其它病原菌均具有较强的拮抗作用，在植物病虫害的防治上具有较好的应用前景，其抗菌成分值得深入研究[14]。本课题组前期的研究发现GZDF3基因组中没有与Bacillibactin嗜铁素合成基因簇相似的基因簇，但存在一个与Petrobactin嗜铁素相似性高达83%的合成基因簇。Petrobactin嗜铁素合成基因簇asbABCDEF，分别与短短芽孢杆菌GZDF3的Gene5689、Gene5690、Gene5691、Gene5692、Gene5693、Gene5694的6个基因相对应[15]。目前Petrobactin嗜铁素相关研究多集中于炭疽芽孢杆菌。2004年，有学者通过定向基因敲除研究了asbA基因的功能，缺铁条件下，asbA缺失突变体表现为嗜铁素产量降低，长势变弱[16]。而且，asbA缺失突变体对老鼠的致病力也显著降低[16]，Nusca等[17]利用柠檬酸、亚精胺、3，4-二羟基苯甲酸底物成功实现了Petrobactin嗜铁素的异源表达，发现AsbA合成酶的功能可以由AsbB进行补偿，即缺失AsbA合成酶，其余5个基因也能合成部分Petrobactin；但是asbE基因缺失，不能合成Petrobactin嗜铁素，意味着asbE基因是Petrobactin嗜铁素合成途径中的关键基因。目前，已经对Petrobactin嗜铁素合成基因簇中的asbB[12]、asbD[13]、asbF[14]进行了功能与结构研究。但对短短芽孢杆菌嗜铁素的研究尚未见报道，因此，基于asbE在嗜铁素合成过程中的重要作用，本研究对短短芽孢杆菌GZDF3菌株Petrobactin嗜铁素合成基因Gene5693(asbE)进行分析，为后续嗜铁素合成基因簇的功能及体外合成研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料

pET-28a质粒的菌种由本课题组保存；表达菌株BL21由生物与工程学院王兵副教授馈赠；短短芽孢杆菌GZDF3由本课题组分离获得，其全基因组序列登录号LVYG00000000。

1.2 方法

1.2.1生物信息学分析 (1)嗜铁素合成酶蛋白的预测，在AntiSMASH(http://antismash.secondarymetabolites.org/)软件里输入短短芽孢杆菌GZDF3全基因组序列(登录号LVYG00000000)，利用AntiSMASH(Ver 3.0.5)预测其代谢产物合成基因簇[18]；利用序列分析软件BioEdit7.0.9.0构建本地短短芽孢杆菌(Brevibacillusbrevis)GZDF3蛋白质序列数据库，以NCBI中检索到的asbE(登录号WP_132131835)蛋白质序列作先导序列， blastp搜索BrevibacillusbrevisGZDF3本地蛋白质序列数据库；(2)嗜铁素合成酶蛋白基本性质分析，用ExPASy(http://www.expasy.org/)分析预测嗜铁素合成酶蛋白的等电点(pI)和相对分子质量(MW)、亲水性及疏水性，用TMpred软件进行跨膜区域分析，用SignalP进行信号肽分析。

1.2.2引物设计 利用DNAMAN软件设计目的基因的引物序列，由生工生物工程(上海)股份有限公司合成，上游引物序列为 5′-CGTGGATCCATGGTTAAGGTTC-3′，下游引物序列为5′-CGTAAGCTTTTACCTCCACCC-3′，其中下划部分分别为BamHⅠ和Hind Ⅲ酶的识别切割位点。

1.2.3目的基因的扩增及纯化 从-80 ℃冰箱取出菌种GZDF3划线培养，从过夜培养的平板中挑取边缘清晰的单菌落放入LB液体培养基中，在摇床中37 ℃振荡培养过夜；按照细菌基因组DNA提取试剂盒操作步骤，提取GZDF3菌株的基因组；以其为模板进行PCR扩增，产物用3 mol/L NaAc和无水乙醇进行纯化。

1.2.4重组质粒的构建及鉴定 将含有pET-28a质粒的E·coli接种于含卡那霉素的LB液体培养基中37 ℃振荡培养过夜，使用OMEGA公司Plasmid Mini KIT按说明书提取pET-28a质粒并纯化；将纯化后的PCR产物Gene5693与pET-28a质粒用酶BamHⅠ和Hind Ⅲ 酶切，随后电泳检测并回收酶切产物，16 ℃连接过夜；将连接后的质粒转化到大肠杆菌BL21感受态细胞中培养过夜，随机挑取5～10个单菌落进行菌落PCR鉴定，选取电泳条带大小与目的基因一致的菌液进行扩大培养，并进行双酶切鉴定，将经菌落PCR 和双酶切鉴定的菌液保存并送深圳华大基因进行测序验证。

1.2.5重组DNA分子的诱导表达及表达产物的纯化 (1)重组DNA分子的诱导表达，将过夜培养的菌液以1% 的接种量进行扩大培养，振荡培养至OD600为0.5左右，取1 mL作为诱导前对照；加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷IPTG进行诱导表达，于30 ℃ 培养4 h；将诱导表达后菌液低温离心10 min，取上清1 mL作为诱导后对照；将离心后菌体用适量PBS溶液进行重悬，在冰水浴中进行超声破碎，破碎后离心收集上清；将诱导前、诱导后，破碎后的样品与蛋白上样缓冲液按4 ∶1混合，煮沸并冷却后点样；通过考马斯亮蓝染色、脱色后观察重组蛋白的表达情况。(2)表达产物的纯化，将诱导表达并进行菌体超声破碎后离心收集的上清，通过Ni-NTA.His纯化柱进行纯化，加入洗杂液，收集液体B1、B2、B3(杂蛋白)；加入洗脱液，收集洗脱液为C1、C2、C3(目的蛋白)；将目的蛋白通过SDS-PAGE电泳检测。

2 结果

2.1 嗜铁素合成酶的生物信息学分析

结果显示，短短芽孢杆菌GZDF3基因组中存在多种编码次级代谢产物的基因簇，其中一种基因簇编码产物为嗜铁素，与文献[15]报道的Petrobactin嗜铁素相似性达83%。以炭疽芽孢杆菌Petrobactin嗜铁素生物合成基因asbE(NCBI登录号WP_132131835 )与本地GZDF3蛋白质序列数据库比对，发现其与短短芽孢杆菌基因组的Gene5693基因相对应，通过DNAMAN中的多序列比对结果如图1A所示，发现Gene5693与AsbE蛋白的氨基酸序列一致性达到51.06%。

2.2 嗜铁素合成酶Gene5693的基本性质

利用ExpASy数据分析系统ProtParam分析，发现嗜铁素合成酶基因Gene5693所编码氨基酸的分子式为C1787H2719N439O511S16，长度为327个氨基酸；分子量为39.05 kDa，理论等电点pI=4.94，为酸性蛋白；不稳定指数为38.04，半衰期为30 h，可初步判定为稳定蛋白。Gene5693有40个正电荷氨基酸残基(Arg+Lys)，57个负电荷氨基酸残基(Asp+Glu)，脂肪系数为88.23；亲水性预测结果如图1B所示，平均亲水性为-0.336，初步判定Gene5693蛋白是亲水性蛋白质，不含有信号肽和跨膜区域。

注：A为Gene5693与asbE的序列比对结果，B为Gene5693蛋白的亲疏性分析。图1 Gene5693与asbE的序列比对及蛋白的亲疏性结果Fig.1 The alignment between Gene5693 and asbE sequences

2.3 目的基因扩增和酶切

以 GZDF3菌株的基因组DNA为模板，经PCR扩增得到目的基因Gene5693，琼脂糖凝胶电泳检测结果如图2A，在1 000 bp处有一条特别明亮的条带，大小与预测的相符。

2.4 重组DNA分子的筛选与鉴定

2.4.1菌落PCR鉴定 菌落PCR鉴定结果如图2B所示，泳道1～5在1 000 bp处都有明亮的条带，与泳道6(阳性对照)大小一致，初步确定Gene5693基因成功连接到质粒上并转化成功。

2.4.2双酶切鉴定及测序验证 将经菌落PCR检测阳性的单菌落扩大培养，提取质粒双酶切后电泳结果如图2C，泳道1～5为重组质粒双酶切后电泳条带，其两条片段大小分别与空载体pET-28a(泳道6)和Gene5693基因(泳道7)一致，表明Gene5693基因成功连接到载体pET-28a上；同时，测序结果经比对分析表明克隆序列与原序列相同，没有发生突变，说明重组质粒构建成功，可用于下一步的诱导表达。

注：M:DL2000 Marker，A为Gene5693基因的PCR扩增、1为PCR产物，B为菌落PCR、1～5为随机挑选的单菌落、6为阳性对照、7为阴性对照，C为重组DNA分子的双酶切、1～5为质粒双酶切产物、6为pET-28a、7为酶切后的Gene5693。图2 Gene5693基因的PCR扩增、菌落PCR及重组DNA分子的双酶切电泳结果Fig.2 Amplification ,colony PCR and double enzymatic digestion of recombinant of Gene5693

2.4.3嗜铁素合成酶Gene5693的原核表达及纯化 将菌株接种于含0.1 mol/L IPTG的培养基中，30 ℃诱导表达4 h，SDS-PAGE结果如图3所示，诱导前后上清(泳道1～2)均无目的条带，诱导表达破碎后上清(泳道3～4)含目的条带。进一步纯化后的目的蛋白(泳道5～8)与预测的理论大小(39.05 kD)一致。

注：M为Marker，1为诱导前上清，2为诱导后上清，3～4为诱导破碎上清， 5～8为纯化后的目的蛋白。图3 表达产物的SDS-PAGE电泳检测Fig.3 The expression of amplified Gene5693

3 讨论

嗜铁素作为微生物次级代谢产物的其中一种，在医学、农业、工业及环境保护中都有重要意义。在生物防治方面，嗜铁素对多种病原菌具有抑制作用，为开发生物农药具有潜在价值。短短芽孢杆菌GZDF3分离自半夏根际土壤，对尖孢镰刀菌等多种病原菌有拮抗作用。本课题组通过AntiSMASH对短短芽孢杆菌GZDF3全基因组序列进行分析，发现GZDF3基因组中没有Bacillibactin嗜铁素合成基因簇，但存在一个与Petrobactin嗜铁素相似性高达83%的合成基因簇。相关文献报道Petrobactin嗜铁素合成基因家族中asbE基因缺失，不能合成Petrobactin嗜铁素，证实asbE基因是Petrobactin嗜铁素合成途径中的关键基因。目前， Petrobactin嗜铁素合成基因簇中的asbB[12]、asbD[13]、asbF[14]基因已有相关的功能与结构研究，而对asbE基因的报道很少，因此本研究对Gene5693(asbE)基因进行生物信息学分析并构建原核表达载体进行重组表达，发现其与AsbE蛋白序列一致性达到51.06%，可认为其同源。利用ExpASy数据分析系统ProtParam程序分析预测嗜铁素合成基因的氨基酸序列和相关的理化性质，初步判定Gene5693蛋白是亲水性稳定蛋白质。2009年，余贤美等[19]在枯草芽孢杆菌 CAS15 嗜铁素基因的表达实验中，用IPTG 在 30 ℃诱导 4 h 实现高效表达，并进行了功能实验验证。目前，还未见短短芽孢杆菌中嗜铁素合成基因的研究。

本研究采用PCR方法克隆了短短芽孢杆菌GZDF3嗜铁素合成基因Gene5693，进行生物信息学和理化性质分析，短短芽孢杆菌GZDF3基因组中存在多种编码次级代谢产物的基因簇，其中一种基因簇编码产物为嗜铁素，并且与Petrobactin嗜铁素相似性达到83%，Gene5693与AsbE蛋白的氨基酸序列一致性达到51.06%，编码的蛋白为酸性蛋白。进一步构建原核表达载体并成功分离纯化获得Gene5693蛋白。

综上所述，本研究成功克隆了短短芽孢杆菌GZDF3嗜铁素合成基因Gene5693并构建重组表达载体，并成功诱导表达。这将为进一步研究短短芽孢杆菌GZDF3中嗜铁素合成基因簇的功能及体外合成研究奠定一定的理论基础，从而为短短芽孢杆菌GZDF3在促进植物生长和植物病害生物防治中的应用提供参考。