黄 岳，刘云秋, 颜欣欣, 杭建雄, 冉荣坤, 孙永祥, 李国清

钩虫是一类被忽视的人兽共患的寄生虫，不仅影响着犬、猫等伴侣动物的生长发育，更是严重危害人类的健康。1990年世界卫生组织首次采用伤残调整生命年(disability-adjusted life years，DALY)来评估钩虫病对人类健康的影响程度，2010年本病导致的缺铁性贫血至少损失了320万DALY[1]。在热带和亚热带贫困地区，大约有7.4亿人正在受到此病的困扰[2]。目前，钩虫的抗凝血机制已经引起了人们的关注，并从一些钩虫分离出具有抗凝血活性的多肽即抗凝肽(anticoagulant peptides)，如犬钩虫的AcaNAP10、锡兰钩虫的AceAP1和十二指肠钩虫的AduNAP4[3-5]。然而，关于钩虫抑制宿主血小板功能的机制尚不清楚。Valle等[6]虽然在犬钩虫中分离出HPI(hookworm platelet inhibitor)蛋白，但对其生物学功能知之甚少。

本研究从锡兰钩虫的cDNA中克隆出AceHPI基因，将其在E.coliBL21(DE3)菌株中进行原核表达，经His标签蛋白纯化试剂盒(Ni-NTA 柱亲和层析法)纯化该融合蛋白,并且通过生物信息学分析预测了该蛋白的生物学特性。

1 材料与方法

1.1 材 料

1.1.1实验虫株 锡兰钩虫成虫由华南农业大学兽医学院临床外科教研室提供。

1.1.2主要试剂 pET-28a原核表达载体由本实验室保存。pMD-19T克隆载体、T4 DNA 连接酶、BamHI和NotI购自宝生物工程(大连)有限公司。BCA蛋白浓度测定试剂盒、E.coliBL21(DE3)工程菌、鼠抗His标签抗体和兔抗鼠IgG-HPR抗体购自生工生物工程(上海)股份有限公司。MicroElute Total RNA Kit和M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit和Gel Extraction Kit D2500购自广州飞扬生物工程有限公司。His标签纯化试剂盒购自碧云天生物技术(上海)公司。

1.2 方 法

1.2.1总RNA提取及反转录 取锡兰钩虫新鲜虫体，依据MicroElute Total RNA Kit试剂盒说明书提取RNA，用紫外分光光度计检测总 RNA浓度，并检测其纯度。参照M-MLV First Strand cDNA Synthesis Kit试剂盒的操作说明书合成第一链cDNA，取总RNA 1 μg、oligo(dT)1 μL，10 mmol/L dNTP mix 1 μL，加DEPC水至18 μL，70 ℃孵育5 min后冰上急速冷却；再依次加入5×反应缓冲液5 μL、RNA酶抑制剂1 μL和逆转录酶1 μL，轻轻混匀并短暂离心后42 ℃孵育60 min，-80 ℃保存备用。

1.2.2AceHPI基因的扩增 参考已知的犬钩虫HPI(AcaHPI)基因序列(No. AF399709.1)，从其ORF 两端设计特异性引物HPI-F和HPI-R，扩增目的基因；再设计上下游引物XL-F2和XL-R2去除目的基因信号肽序列(表1)。反应条件：94 ℃预变性5 min；94 ℃变性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸80 s，共35个循环；最后72 ℃延伸8 min。

表1 RT-PCR引物序列
Tab.1 Sequences of the primers for RT-PCR

NameSequenceProduct length /bpHPI-F5′-ATGAGCTCTTATCTTCTGGT-3′603HPI-R5′-TCAGTGACCAATGCAGAGCAAAT-3′XL-F25′-CGGGATCCGAAGGTGACTATTCGC-TATGCCAGC-3′568XL-R25′-TGGCGGCCGCGTGACCAATG-CAGAGCAAATTCT-3′

The underlined parts are the restriction enzyme sites ofBamHI andNotI

1.2.3原核表达载体的构建 采用BamHI、NotI双酶切质粒pET-28a和目的基因PCR产物，对其酶切产物纯化回收并用T4连接酶连接, 转化感受态E.coliBL21(DE3), 挑取单菌落, 在卡那霉素抗性LB 液体培养基中培养, 取1 μL菌液进行PCR 验证, 将其阳性克隆送去生工生物工程(上海)股份有限公司测序。

1.2.4融合蛋白的表达与纯化 将含有重组质粒pET28a-AceHPI的大肠杆菌E.coliBL21(DE3)接种于10 mL卡那霉素(50 μg/mL)的LB培养基中培养过夜, 再按1∶100比例转接于200 mL卡那霉素液体培养基中，37 ℃, 185 r/min扩大培养。待菌液OD 值达到0.4～0.6时，加入终浓度为 0.1 mmol/L的IPTG, 在28 ℃、165 r/min诱导6～10 h。离心收集菌体后, 再用10 mL PBS 悬浮菌体。菌液冰浴、超声波破碎，所得细胞裂解液在12 000×g下离心10 min。收集上清液采用His标签蛋白纯化试剂盒进行纯化。纯化后的重组蛋白使用BCA蛋白浓度测定试剂盒测定其浓度。

1.2.5融合蛋白的Western-blot鉴定 将重组菌裂解上清液进行SDS-PAGE电泳，在转膜仪上15V处将其转移到硝化纤维膜上，在含0.5%脱脂奶粉的TBST(含0.05%吐温-20的TBS)中封闭2 h，再用鼠抗His标记单克隆抗体(1∶6 000)和辣根过氧化物酶(HRP)结合兔抗鼠IgG(1∶20 000)孵育。采用Dab法检测AceHPI融合蛋白的反应原性。

1.2.6AceHPI的生物信息学分析 根据锡兰钩虫AceHPI基因核苷酸序列推测其蛋白的氨基酸序列，用DNAMAN软件将其与犬钩虫AcaHPI的氨基酸序列进行同源性比对。用DNAStar 软件分析AceHPI蛋白的分子质量、等电点等理化性质。用ProtScale 软件(http://web.expasy.org/cgi-bin/protscale/protscale.pl)分析AceHPI蛋白的疏/亲水性；用在线工具SignaIP4.1(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)分析AceHPI信号肽序列；用在线软件(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)对AceHPI 氨基酸序列进行跨膜结构域分析；用SWISS-MODEL三级结构预测软件(http://swissmodel.expasy.org/)建立该蛋白的三维结构预测模型。

2 结 果

2.1目的基因PCR扩增与重组质粒的鉴定 以锡兰钩虫cDNA为模板进行PCR 扩增、克隆和测序，获得了全长为603 bp的基因序列(No. MK087839)。重组质粒pET28a-AceHPI用BamHI和NotI酶切后，获得了大小约为603 bp的AceHPI片段，与预期目的片段大小一致(图1)。

M: DNA marker; 1: Products from pET28a-AceHPI digested with BamHI and Not I.图1 重组质粒pET28a-AceHPI双酶切鉴定Fig.1 Double enzyme digestion identification of pET28a-AceHPI

2.2融合蛋白的表达与鉴定 阳性质粒pET28a-AceHPI转化E.coliBL21(DE3)菌株后，在IPTG诱导下其融合蛋白得到了有效表达。经SDS-PAGE分析，该融合蛋白的分子量约为26 kDa。采用50 mmol/L的洗脱缓冲液洗脱，该融合蛋白产率约为1.1 mg/mL(图2A)。经Western blot分析，与抗HIS标签抗体结合的蛋白约为26 kDa(图2B)，其大小与AceHPI融合蛋白的理论值一致。

2.3AceHPI蛋白同源性与生物信息学分析 测序结果显示，AceHPI基因长度为603 bp，共编码200个氨基酸(图3)。通过DNAMAN软件比对，AceHPI与AcaHPI蛋白氨基酸序列同源性高达91%。

利用在线软件对其氨基酸序列进行生物信息学分析，结果显示，该蛋白分子质量和等电点分别为22.5 kDa和7.0；疏水性平均系数(GRAVY)大于0，推测为疏水性蛋白(4A)；无跨膜结构域(4B)，且该蛋白前17个氨基酸为信号肽序列(4C)；其三维结构模型(4D)的全球性模型质量估测值(GMQE值)为0.88，表明其建模质量良好。

M: protein molecular weight marker; 1: product from induced pET28a-AceHPI; 2: precipitate of bacteria lysate;3: supernatant of bacteria lysate; 4: purified recombinant protein; 5: blank control; 6: recombinant proteins from pET-28a-AceHPI identified with the anti-His monoclonal antibody.图2 重组蛋白AceHPI的SDS-PAGE(A)和Western-blot(B)分析Fig.2 SDS-PAGE (A) and Western-blot (B)analysis of the expression product of pET28a-AceHPI

图3 AceHPI氨基酸序列的同源性比对Fig.3 Homology alignment of the amino acid sequence of AceHPI

A: hydrophilicity analysis of AceHPI; B: prediction of transmembrane helices in AceHPI; C: signal peptide analysis of AceHPI; D: prediction of tertiary structure of AceHPI.图4 AceHPI蛋白的生物信息学分析Fig.4 Bioinformatics analysis of AceHPI protein

3 讨 论

钩虫病是一种以贫血为主的慢性消耗性疾病，对人类和伴侣动物(如犬、猫)的健康具有潜在威胁。锡兰钩虫是唯一一种可以在人体内发育为成虫且可导致人重度感染的动物源性钩虫。由于它可以感染金黄仓鼠，常作为钩虫病研究的动物模型。钩虫血小板抑制剂的研究始于犬钩虫和美洲钩虫，最早发现其成虫的可溶性蛋白提取物和分泌排泄产物具有抑制二磷酸腺苷与纤维蛋白原诱导血小板聚集的功能[7-9]，后续研究表明该抑制剂可以阻断GPIIb/IIIA和GPIA/IIA受体与各自配体的结合从而抑制血小板聚集[10-11]。据此Valle等[6]采用RP-HPLC技术从犬钩虫成虫体内分离出具有上述阻断功能的两种钩虫血小板抑制剂，并用RACE-PCR技术首次扩增出AcaHPI。分析AcaHPI蛋白结构后，发现其具有不完全保守的CAP1至CAP 4序列，被认为是CAP超家族成员[12]，具有作为钩虫疫苗候选分子的潜力。

本研究首次报道了锡兰钩虫AceHPI基因的原核表达。由于该蛋白序列N端存在真核生物的信号肽序列，因而在E.coliBL21(DE3)菌株中表达量很低。为了提高该蛋白的表达量，随后设计了一对去除信号肽序列的引物，避免了真核生物蛋白在原核表达时产生的不兼容性。由于HPI蛋白为疏水性蛋白，前人对犬钩虫血小板抑制剂的研究一直未能采用原核表达系统对该蛋白进行可溶性表达。虽然Ma等[12]对其原核表达的融合蛋白包涵体进行了复性，但复性后的蛋白并不能保证其正确折叠且具有生物学活性。为了获得可溶性AceHPI融合蛋白，本研究尝试在低温、低IPTG浓度和低转速下诱导表达，结果在28 ℃、0.1 mmol/L浓度的IPTG和165 r/min的转速下，可溶性融合蛋白的表达量明显增加。本研究发现锡兰钩虫AceHPI与犬钩虫AcaHPI的同源性为91%。利用相关软件对其蛋白的亲/疏水性、跨膜结构域、信号肽序列和二级结构进行了分析并绘制其三维结构模型，表明其为疏水蛋白，无跨膜结构域，具有信号肽序列且位于前17个氨基酸，这些信息将有助于进一步研究该蛋白的结构特性。

本研究成功克隆了锡兰钩虫AceHPI基因，构建了其重组表达质粒并进行了原核表达，对其编码的氨基酸序列进行了生物信息学分析。上述研究为深入探究锡兰钩虫HPI在感染宿主体内的作用机制奠定了基础。

利益冲突：无