张 权，肖 智△，秦 颖

(遵义医科大学：1.贵州省普通高等学校脑科学特色重点实验室；2.医学与生物学研究中心，贵州遵义 563000)

体表组织缺损形成的慢性创面是临床外科的常见病和多发病，伴疼痛、感染和功能障碍等并发症。目前临床主要通过皮瓣移植、使用生物工程材料、高压氧、电磁疗法及干细胞移植等多种治疗手段促进创面修复[1-3]。但是创面修复区往往出现触、压、温、痛等感觉功能的减退甚至消失。有研究提示，触压觉功能的缺失是导致创面修复失败的重要原因之一[4]。触觉与默克尔细胞(Merkel细胞)分布有关，该细胞存在于表皮与真皮交界的网状脊上，与真皮层Aβ类感觉传入神经纤维末梢紧密接触，并形成类似于神经解剖上的突触结构，称为Merkel细胞-神经突复合体[5-6]。该复合体在皮肤触觉高敏感区域数量较多，例如老鼠的须垫、硬腭和背部皮肤及人体的指腹、嘴唇等[7]。湿润烧伤膏(moist exposed burn ointment，MEBO)应用到创面是以液化的方式无损伤地排除坏死组织，以原位干细胞培植的方式再生修复创面[8]；此外，MEBO还具有双向调节作用[9]，在创面愈合过程的早期具有“保湿”和促进“生肌”的作用。虽有大量文献报道MEBO促进创面愈合的作用，但针对MEBO在创面神经再生及触觉重建方面的研究却鲜见报道。通过本研究一方面可以加深对触觉形成机制的认识，另一方面，可以为临床使用MEBO促进创面触觉功能重建提供理论依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1实验动物及分组 无特殊病原体(SPF)级成年健康SD雄性大鼠共60只，体质量240～260 g，由长沙天勤生物技术有限公司提供，许可证号：SCXK(沪)2008-0016。大鼠每4只一笼饲养，置于温度(25±2)℃、湿度(52±2)%环境中自由饮食，自然采光，适应环境1周。采用随机数字表法将大鼠分为正常组(N组)、创面7 d组(D7组)、创面14 d组(D14组)、MEBO治疗7 d组(MEBO7组)和MEBO治疗14 d组(MEBO14组)。N组大鼠不做任何处理；D7组、D14组、MEBO7组和MEBO14组大鼠建立足底全层皮肤缺损开放性创面模型，其中MEBO7组和MEBO14组大鼠建模后每6～8小时用无菌棉签将MEBO涂于足底创面，厚约1 mm，创面上加盖两层MEBO涂抹的湿润消毒纱布，用胶布固定治疗，每天换药3～4次。本实验严格按照有关实验动物伦理纲要进行操作，研究中尽量减少动物使用量和动物所承受的痛苦。

1.1.2实验试剂及主要仪器 MEBO(汕头市美宝制药有限公司，产品批号：1703903A)。兔抗大鼠细胞角蛋白20(CK-20)单克隆抗体(美国Abcam公司，货号：ab76126)、3%牛血清清蛋白、辣根过氧化物酶标记山羊抗兔IgG、二氨基联苯胺(DAB)显色试剂盒、抗体稀释液、RIPA裂解液均购于碧云天生物有限公司，水合氯醛(成都市科龙化工试剂厂)；冰冻切片机(Leica-CM1950型，德国Leica公司)，Von Frey针刺痛觉测试套件Aesthesio(香港友诚生物科技有限公司)，倒置荧光显微镜(IX53+DP73型，日本Olympus公司)。

1.2方法

1.2.1足底创面大鼠模型建立 大鼠腹腔内注射4%水合氯醛(10 mL/kg)，麻醉成功后，大鼠足底用0.5 %聚维酮碘溶液消毒后切除深度达筋膜层6 mm×5 mm的皮肤全层，建立足底全层皮肤缺损大鼠模型。大鼠清醒后单独分笼饲养。

1.2.2触觉功能检测 将大鼠置于金属网上，盖以透明有机玻璃罩，适应环境30 min。待大鼠探索行为结束后进行触觉功能检测。触觉测定采用Von Frey纤维丝，将纤维丝头端垂直接触大鼠足底，使尖端略弯曲，每次刺激持续时间最长不超过2 s，若在规定时间内大鼠出现缩足反射或足部肌肉收缩，则更换相邻小一级纤维丝；若大鼠未出现缩足反射或足部肌肉收缩，则替换大一级纤维丝刺激，相邻测试时间间隔10 s。检测前去除足底创面的坏死组织，检测区域固定在足底创面中央。检测时间为建模前(0 d)和建模后7、14 d。

1.2.3免疫组织化学染色检测组织CK-20阳性细胞 按照随机数字表法取建模后7 d或14 d的各组大鼠(n=6)，4%水合氯醛(20 mL/kg)腹腔内注射，深度麻醉后，剔除坏死组织，取大鼠足底创面新生肉芽组织，沿皮面平行切下肉芽组织后按分组分别置于4%多聚甲醛溶液中，4 ℃冰箱保存4 h后转移至30%蔗糖多聚甲醛溶液中(4 ℃保存)，8～10 h沉底后取出足底肉芽组织，用OCT包埋剂(Sakura Tissue-Tek型，美国樱花公司)包埋后置于-20 ℃冰冻切片机中50 min。沿冠状位连续切片，厚25 μm。每4～5张皮肤切片取1张进行免疫组织化学染色分析，每只大鼠取10张。皮片磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗和血清封闭后加入一抗(兔抗大鼠CK-20抗体)和二抗[辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG (H+L)]；DAB显色，梯度乙醇脱水，生物透明剂透明后封片，光镜下观察并采集图像。采用Image-Pro Plus6.0图像分析软件(美国Media Cybernetics公司)对皮肤CK-20阳性图片进行CK-20受体阳性细胞计数。每张取5个不重叠的视野，计数每一个视野中的CK-20阳性细胞数，取均值。

1.2.4蛋白质印迹法(Western blot)检测组织CK-20表达水平 取建模后7 d或14 d每组大鼠(n=6)，足底新生肉芽组织取材方法同免疫组织化学，置于-80 ℃冰箱保存备用。取出皮肤新生肉芽组织称重，研碎后加入RIPA裂解液(含PMSF，1∶100)，超声波粉碎；离心后取上清液，二喹啉甲酸(BCA)法蛋白定量(蛋白定量为100 μg/μL)；2倍上样缓冲液与样品(1∶1)煮沸8 min，离心，-20 ℃冰箱保存。配胶，各泳道取20 μL(每条泳道蛋白含量20 μg)加样，电泳后，电转至聚偏氟乙烯(PVDF)膜，TBST封闭1 h。加入一抗：兔抗大鼠CK-20抗体(1∶5 000)和小鼠抗大鼠β-actin(1∶2 000)，4 ℃冰箱孵育，过夜后洗膜，加入二抗，室温孵育、洗膜。化学增强发光试剂与PVDF膜共孵育后显影、定影。图像进行目标条带扫描(方正扫描仪F5600)，Bio-Rad生物图像处理系统(PDQUEST)进行分析，以β-actin为内参对照，对所测目标蛋白的条带吸光度值(A值)进行标准化，得到各组CK-20蛋白相对吸光度值(RA值)。

2 结 果

2.1大鼠足底创面触觉功能变化 用Von Frey纤维丝检测各组大鼠足底触觉阈值。建模前，各组大鼠触觉阈值均值为(4.03±0.35)g，组间比较差异无统计学意义(P>0.05)；观察时间内N组大鼠触觉阈值相对变化不大，为(4.07±0.39)g；D7组触觉阈值为(43.22±9.16)g，D14组触觉阈值为(11.43±2.45)g，D7组、D14组分别与N组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；MEBO7组触觉阈值为(8.54±1.05)g，MEBO14组触觉阈值为(4.75±0.97)g，MEBO7组、MEBO14组分别与N组比较，差异有统计学意义(P<0.05)；MEBO7组与D7组比较，MEBO14组与D14组比较，触觉阈值均下降，差异有统计学意义(P<0.05)。均数组间比较，差异有统计学意义(F=208.9，P=0.000)，见图1。

*：P<0.05，与N组比较；#：P<0.05，与D7组比较；△：P<0.05，与MEBO7组比较；▲：P<0.05，与D14组比较

图1各组大鼠触觉阈值比较

A：N组；B：D7组；C：MEBO7组；D：D14组；E：MEBO14组；F：各组大鼠足底正常皮肤或创面新生肉芽组织CK-20阳性细胞数比较；*：P<0.05，与N组比较；#：P<0.05，与D 7组比较；△：P<0.05，与MEBO7组比较；▲：P<0.01，与D 14组比较；图中红色箭头所示：CK-20免疫阳性细胞(免疫组化染色，标尺为100 μm)

图2各组大鼠足底正常皮肤组织或创面新生肉芽组织CK-20阳性细胞表达

2.2大鼠足底创面新生肉芽组织CK-20阳性的Merkel细胞数量变化 足底正常或创面新生肉芽组织免疫组织化学检测发现，位于皮肤表皮与真皮交界面的网状脊尖端有成串的CK-20阳性细胞表达，见图2。N组大鼠CK-20阳性细胞表达排列整齐，染色较深；与N组大鼠比较，D7组和D14组CK-20阳性细胞数明显减少且D7组大鼠CK-20阳性细胞排列紊乱；创面经多次涂抹MEBO后，MEBO7组和MEBO14组大鼠足底创面新生肉芽组织CK-20阳性细胞数较同观察时间点的D7组和D14组增多，但仍低于N组；MEBO7组与MEBO14组大鼠比较，MEBO14组大鼠足底创面新生肉芽组织CK-20阳性细胞数增多。均数组间比较，差异有统计学意义(F=6.340，P=0.001)，见图2。

2.3大鼠足底创面新生肉芽组织CK-20蛋白水平变化 Western blot检测大鼠正常或足底创面新生肉芽组织发现相对分子质量约为48×103的阳性条带，与目标蛋白CK-20的相对分子质量吻合。以β-actin为内参对照，对所测目标蛋白的条带A值进行标准化，得到各组大鼠CK-20蛋白RA值。与N组比较，D7组和D14组足底组织CK-20蛋白RA值明显下降；创面经多次涂抹MEBO后，MEBO7组和MEBO14组CK-20蛋白RA值较同观察时间点的D7组和D14组增多，但仍低于N组，均数组间比较，差异有统计学意义(F=14.74，P=0.000)，见图3。

A：各组大鼠足底正常皮肤或创面新生肉芽组织CK-20蛋白Western blot条带；B：定量统计；*：P<0.05，与N组比较；#：P<0.05，与D7组比较；△：P<0.05，与MEBO7组比较；▲：P<0.05，与D14组比较

图3各组大鼠足底正常皮肤或创面新生肉芽组织CK-20蛋白表达水平比较

3 讨 论

高等生物的皮肤是体内与体外环境接触的重要媒介，皮肤上存在大量复杂的触觉感受器感知外环境的变化刺激。触觉感受器可以通过机械激活的离子通道把压力、张力等机械信号转变为感受器上的电信号形成感受器电位，并将经编码的电信号通过传入神经投射到高级神经中枢(皮层躯体感觉中枢)，产生触摸感觉。通常认为，Merkel细胞神经突复合体是Merkel细胞与Aβ传入纤维末梢形成突触样结构，感受器电位通过Aβ传入纤维传入，并将物体的形状、质地及空间属性等进行编码[10-12]。大鼠Merkel基因敲除或沉默后，大鼠足底无毛区不能辨别物体表面纹理、质地，但是大鼠胡须区仍然保留上述鉴别能力，表明Merkel细胞-神经突复合体对保持手掌、足底等无毛区对物体的鉴别能力是必须的，而对胡须区的触觉无明显作用[13-14]。

Merkel细胞具有特殊的细胞结构特点，如共表达内分泌颗粒、角蛋白丝和桥粒蛋白。常规苏木精-伊红(HE)染色很难在镜下区分Merkel细胞，有文献报道，在体鉴定Merkel细胞的主要方法是采用抗角蛋白抗体，其中在胎儿和成人皮肤中，仅仅Merkel细胞表达CK-20，因此，CK-20可以作为Merkel细胞的标记蛋白[15-16]。本研究采用免疫组织化学法标记CK-20表达阳性的方法鉴定Merkel细胞，结果显示在正常大鼠网状脊或建模大鼠足底创面新生肉芽组织中均有CK-20阳性细胞表达。有研究提示，组织中Merkel细胞数量会根据环境的变化上升或下降，作出适应性调节，例如：随着毛囊周期的变化，Merkel细胞数量和分布出现生理性波动[16]；此外，在不同的神经营养因子作用下，Merkel细胞数量也会出现波动[17]。本研究结果与上述结论一致，大鼠切除足底皮肤后，其足底触觉阈值显著升高，创面新生肉芽组织中CK-20阳性的Merkel细胞数量减少，CK-20蛋白水平降低，此现象可能与足底创面形成导致创面新生肉芽组织中Merkel细胞丢失有关。研究还显示，大鼠足底创面建模后7 d与14 d比较，在创面逐渐愈合的过程中，足底创面触觉阈值逐渐降低，创面新生肉芽组织中CK-20阳性的Merkel细胞数量增加，CK-20蛋白水平上调，其机制可能与足底创面愈合过程中局部多种神经营养因子、神经肽等物质促进Merkel细胞生成有关，究竟哪些因子促进CK-20阳性Merkel细胞数量增加，其具体机制还需进一步研究证实。

祖国医学通过辨证论治，将中药制剂外用于皮肤创面，促进创面的愈合和功能的恢复。MEBO是一种中药制剂，主要由黄芩、黄柏、黄连、蜂蜜、麻油等组成，有清热燥湿，泻火解毒、去腐生肌的功能，是一种具有较强的广谱抗菌作用和促进创面愈合的双向调节作用的药物，能向受损的机体局部皮肤组织残存细胞提供维持正常生长的环境和促进分裂再生的条件。该药膏治疗皮肤缺损有良好的止痛、抗感染、改善局部微循环、增强免疫力、促进上皮细胞的增殖、清除坏死组织等功能。本研究发现，与未用MEBO治疗的建模大鼠比较，在相同的观察时间点，建模大鼠足底创面外用MEBO后，其创面新生肉芽组织中CK-20阳性的Merkel细胞数量增加，CK-20蛋白水平上调，创面触觉阈值降低。有研究提示，Merkel细胞不表达细胞周期蛋白，因此，Merkel细胞可能分化来源于周围未分化的多能基底角质细胞(pluripotential basal keratinocytes)[18]，因此，外用MEBO可能通过促进多能基底角质细胞分化为Merkel细胞，进而促进创面触觉功能的重建，本设想还需进一步研究证实。

综上所述，采用皮肤创面外用MEBO能够有效促进创面新生肉芽组织触觉功能重建。