刘 伟，李蔷薇，王 静，潘跃银

我国肺癌的发病率和死亡率在所有癌症中位居第一位，而其中非小细胞肺癌(non- small cell lung cancer，NSCLC)所占比例最多，约为80%～85%[1-2]。腺癌约占非小细胞肺癌的55%左右，其最常见的肿瘤驱动基因是表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor,EGFR)基因敏感性突变[3]。约65%EGFR突变的肺腺癌患者使用第一代EGFR酪氨酸激酶抑制剂(EGFR- tyrosine kinase inhibitors,EGFR- TKIs)10～14个月后出现继发性耐药[4]。因T790M突变导致耐药的患者改用第三代EGFR- TKI奥希替尼(osimertinib)后无进展生存期也仅为8～18个月，最终仍不可避免出现耐药[5]。

天然类黄酮槲皮素(quercetin)所具有的抗肿瘤特性已受到研究人员的关注和认可[6]。第一代EGFR- TKI吉非替尼联合槲皮素表现出显著的协同抗肿瘤作用[7]。该研究的目的是探讨奥希替尼与槲皮素联合使用后对NCI- H1975细胞增殖以及凋亡潜在的作用机制。

1 材料与方法

1.1 主要材料H1975细胞株由广东省肺癌研究所无偿馈赠。奥希替尼购自英国Astra Zeneca公司；槲皮素、二甲基亚砜(DMSO)购于美国Sigma公司；MTT、ECL检测试剂盒及BCA蛋白浓度测定试剂盒、兔抗人β- actin多克隆抗体及辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG(即二抗)购于北京索莱宝公司；RPMI- 1640培养液购自美国HyClone公司；Annexin V- FITC/PI双染细胞凋亡检测试剂盒购于南京建成公司；胎牛血清(FBS)、青链霉素混合液、SDS- PAGE凝胶快速配制试剂盒和RIPA裂解液均购自北京碧云天生物公司；兔抗人磷酸化Akt(p- Akt)单克隆抗体、兔抗人Bax单克隆抗体、兔抗人Bcl- 2单克隆抗体、兔抗人蛋白激酶B(Akt)多克隆抗体购自于英国abcam公司。

1.2 药物配制与保存RPMI- 1640培养液按10%FBS的体积分数、1×105U/L青霉素、1×105μg/L链霉素浓度配制保存于4 ℃冰箱。奥希替尼用PBS溶解，而槲皮素则用DMSO溶解，置于-20 ℃冰箱中保存。使用时，根据所需实验浓度用培养液予以稀释，且DMSO最终的体积浓度需<0.1%。

1.3 细胞培养H1975细胞置于RPMI- 1640新鲜培养基中，保存于37 ℃ CO2培养箱内。H1975细胞的传代时间为48～72 h，取对数生长期的培养细胞用于实验。

1.4 使用MTT法检测奥希替尼联合槲皮素对H1975细胞增殖的影响将H1975细胞消化混匀接种于96孔板(各孔细胞数5×103)，培养箱中培养24 h；用PBS将奥希替尼稀释成2.625、5.25、10.5、21、42、84 μmol/L浓度梯度组，同样用DMSO分别将槲皮素稀释成15.625、31.25、62.5、125、250、500 mmol/L浓度梯度组。再用RPMI- 1640培养基按1 ∶1 000分别稀释各浓度组的奥希替尼至终浓度为2.625、5.25、10.5、21、42、84 nmol/L、各浓度组的槲皮素至终浓度为15.625、31.25、62.5、125、250、500 μmol/L。同时将各浓度组的奥希替尼和槲皮素在同一管中稀释1 000倍，即为奥希替尼和槲皮素联合组。将原孔培养基弃去，3块96孔板分别加入稀释后的奥希替尼、槲皮素及两药联合组，每个稀释度设置6个复孔，并相应设置 PBS和DMSO对照组以及空白对照组。CO2培养箱培养72 h后，每孔加入10 μl MTT(5 g/L)溶液。细胞在培养箱中孵育4 h后，使用1 ml注射器小心吸走各孔中的上清液，每孔加入100 μl DMSO(200 μl/孔)，摇床摇动15 min。使用酶标仪读取各孔的吸光度(optical density，OD)值，根据OD值计算可得出奥希替尼及槲皮素对细胞的抑制率。利用GraphPad Prism5软件计算两药半数抑制浓度(half inhibitory concentration,IC50)，使用Compu Syn软件计算两药联合指数(CI)值。

1.5 流式细胞仪检测奥希替尼联合槲皮素对NCI- H1975细胞整体凋亡的影响根据以上MTT检测得出的结果，将奥希替尼、槲皮素稀释至22 nmol/L和110 μmol/L，然后将H1975细胞分成4组：空白对照组、22 nmol/L 奥希替尼组、110 μmol/L槲皮素组、22 nmol/L奥希替尼+110 μmol/L槲皮素联合组，将各组药物加入6孔板中(每孔细胞数为1×106个)。处理72 h后进行细胞凋亡检测，将6孔板中的各组细胞培养液吸出至合适离心管内，使用PBS液轻轻洗涤贴壁细胞2次，最后使用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞。待细胞消化下来后，使用吸管将细胞加入此前收集细胞培养液的离心管内，稍稍混匀，离心后收集细胞沉淀，用PBS液轻轻使细胞重悬后计数； 取5×105个重悬的细胞，1 000 r/min离心5 min，弃上清液，接种至新的6孔板中。各孔加入500 μl AnnexinⅤ- FITC/ PI凋亡检测试剂盒中的结合液，轻轻使细胞重悬； 再加入5 μl Annexin V- FITC，轻轻混匀；最后加入5 μl碘化丙啶，再次混匀。随后在室温下将细胞用铝箔包裹避光孵育10 min，然后应用流式细胞仪检测，待检测完成后使用 FlowJo7.6.1 软件分析出各分组细胞的凋亡率。

1.6 蛋白免疫印迹法检测奥希替尼联合槲皮素作用后对 H1975细胞中 p- Akt、Bcl- 2及Bax蛋白表达的影响收集22 nmol/L 奥希替尼、110 μmol/L 槲皮素、22 nmol/L奥希替尼+110 μmol/L 槲皮素作用72 h后细胞，以及空白对照组细胞进行Western blot检测。步骤如下：将细胞消化，离心5 min收集细胞；用PBS液轻轻洗涤细胞2次，再次离心收集细胞沉淀；每管细胞沉淀加入100 μl RIPA(含1 mmol PMSF);将细胞吹匀，放置于冰上裂解30 min，在此期间每5 min将细胞上下颠倒操作1次，收集上清液即为裂解后蛋白液；BCA蛋白浓度测定试剂盒测定各蛋白质的浓度后沸水煮15 min，低温高速离心机离心10 min(12 000 r/min)。将各待测样品加入8%～10%SDS- PAGE凝胶中电泳，然后冰浴下转膜，接着在室温条件下用5%脱脂奶粉将转好的膜封闭2 h。加入按合适比例的抗体稀释，其中anti- Bax按1 ∶3 000稀释；anti- Bcl- 2按1 ∶1 000稀释；anti- Akt按1 ∶3 000稀释；anti- p- Akt按1 ∶5 000稀释；anti- β- actin按1 ∶2 000稀释。放置于4 ℃冰箱过夜，然后使用TBST液清洗3次，每隔10 min洗1次，之后加入二抗，抗体稀释度为1 ∶3 000，室温孵育约1 h，再次TBST液涮洗5次，每10 min洗1次。避光显影后使用Image J软件分析待测蛋白的灰度值。

2 结果

2.1 奥希替尼联合槲皮素作用对H1975细胞的增殖抑制效应MTT结果显示，作用72 h后，奥希替尼和槲皮素对H1975细胞的IC50值分别为(21.54±1.05) nmol/L和(109.7±1.08)μmol/L，细胞增殖的抑制率随着药物浓度的增加而增高，不同浓度的药物对细胞抑制率的差异有统计学意义(F=59.34、101.25，P<0.01)(图1)。 经过计算，不同浓度的奥希替尼联合槲皮素处理组CI值均<1，显示出明确的协同抑制作用(图2)。

图1 MTT检测奥希替尼和槲皮素对NSCLC H1975细胞的增殖抑制效应

图2 奥希替尼联合槲皮素作用于NSCLC H1975细胞的CI值

2.2 各药物处理组H1975 细胞的凋亡率经流式细胞仪检测，奥希替尼单药和槲皮素单药处理72 h后的H1975细胞的凋亡率分别为17.14%和23.5%，而两药联合处理后为47.8%。与单药组及对照组比较，奥希替尼和槲皮素联合组细胞的凋亡率明显增高，差异有统计学意义(F=226.38，P<0.01) (图3)。

2.3 奥希替尼和槲皮素处理后H1975细胞中Akt/p- Akt及Bcl- 2、Bax蛋白的表达根据Western blot检测结果可见，与对照组、奥希替尼单药处理组和槲皮素单药处理组比较，双药联合处理组中，H1975细胞中p- Akt蛋白的表达水平明显下调，差异有统计学意义(F=143.48，P<0.01)；联合组bcl- 2蛋白表达水平显著低于对照组和单药组，差异有统计学意义(F=58.72，P<0.01)。与奥希替尼单药组比较，奥希替尼和槲皮素两药组bax蛋白表达水平明显升高，差异有统计学意义(F=73.31，P<0.01)(图4)。

图3 流式细胞术法检测奥希替尼联合槲皮素对|NSCLC H1975 细胞凋亡率的影响

A:各组细胞的流式细胞仪检测结果；B：各组细胞的凋亡率；a：对照组；b：奥希替尼单药组；c：槲皮素单药组；d：两药联合组；与对照组比较：**P<0.01；与奥希替尼单药组比较：##P<0.01；与槲皮素单药组比较：&&P<0.01

3 讨论

亚洲EGFR阳性的非小细胞肺癌在肺癌中所占比例为30%～40%[8]。分子靶向药物的出现改变了该类型肺癌的治疗模式，第一代EGFR- TKI初始取得良好疗效，但很快出现继发性耐药，而最常见的耐药原因为T790M突变(约60%)[9]。第三代EGFR- TKI奥希替尼可选择性抑制T790M突变的EGFR[5]。而根据Jänne et al[10]对127例EGFR- T790M突变阳性的患者所进行的Ⅰ期临床试验中，对奥希替尼的客观缓解率达到61%，然而中位无进展生存期仅仅为9.6个月。

图4 Western blot检测奥希替尼联合槲皮素对NSCLC H1975细胞中目的蛋白(Akt、p- Akt、Bcl- 2及Bax)表达的影响

A:对照组;B:奥希替尼单药组;C:槲皮素单药组;D:两药联合组；与对照组比较：**P<0.01；与两药联合组比较：△△P<0.01

槲皮素是一种天然的类黄酮，槲皮素是一种天然类黄酮，存在于许多中草药和食品中，如银杏、三七、苹果、洋葱、绿茶等。其抗肿瘤特性贯穿于癌变的各个阶段，从肿瘤发生到侵袭和转移，并在不同的遗传、生化和免疫方面发挥作用，因此在近年来引起了癌症研究人员的关注[6]。研究[11]显示，槲皮素通过不同类型癌细胞的细胞内机制，增强了紫杉醇和顺铂等几种化疗药物对肿瘤细胞的生长抑制作用。

磷脂酰肌醇3激酶(phosphoinositide3- kinase，PI3K)/蛋白激酶B(Akt)信号转导途径是肿瘤发生发展过程中起关键性作用的一类信号通路。在多种肿瘤中观察到PI3K/Akt通路的过度激活，致使细胞凋亡受阻[12]。Wang et al[13]研究发现当PI3K/Akt通路的活性被抑制时，顺铂耐药的非小细胞肺癌细胞对化疗药物的敏感性增强。当PI3K开始活化，AKT的蛋白结构转变为具有激酶活性的p- Akt，使得下游效应分子中具有抗凋亡效应的原癌基因如Bcl- 2的表达也随之增加，从而抵抗放化疗所引起的肿瘤细胞凋亡，而Bax是Bcl- 2的同源基因，其编码的蛋白与Bcl- 2形成异源二聚体后可对Bcl- 2的表达产生阻抑作用，因而被认为是一种重要的促细胞凋亡基因[14]。

本研究将第三代EGFR- TKI奥希替尼联合槲皮素作用于T790M突变阳性的 H1975细胞，验证两种药物是否具有协同作用。实验结果表明，奥希替尼联合槲皮素可以更显著地抑制细胞增殖，各实验组的CI值均<1，显示出协同抑制作用。流式细胞术还进一步表明，奥希替尼联合槲皮素组所引起的H1975细胞凋亡比单一药物组更为明显，表现出更强的诱导细胞凋亡作用，其机制可能为两药联合后下调Akt的磷酸化水平，使得抗凋亡Bcl- 2蛋白的表达受到抑制而促凋亡Bax蛋白的表达量增加。由此可见，槲皮素联合奥希替尼可对 H1975细胞产生协同抗增殖与促凋亡作用。当然，本研究为体外实验，尚未建立动物模型验证，其作用有待进一步研究证实。