巴桑珠扎　李斌　刘柳　姜南

摘要：选取10头西藏黄牛，对黄牛瘤胃微生物进行研究，分析瘤胃液物质特征值，对黄牛瘤胃中可溶性糖含量及N源进行测定，选取培养基对真菌、细菌进行分离、改良、培养，进而得出瘤胃内可溶性糖及不同N均處于动态变化的过程，其中微生物含量和黄牛瘤胃中的养分以及食物在瘤胃内停留的时间有关，此外，还对黄牛瘤胃内纤毛虫的数量及变化趋势进行鉴定。

关键词：黄牛;瘤胃微生物;瘤胃液物质

中图分类号：S823

文献标识码：B

doi：10.3969/j.issn.2096-3637.2019.05.004

0引言

黄牛在西藏畜牧业中占很大的比例，目前，对于西藏黄牛瘤胃内微生物、瘤胃液物质特征值进行的研究较少，但对于黄牛瘤胃内微生物数量、种类、变化规律进行掌控，便于更好对草牧资源进行利用。未来极有可能利用各种基因工程，对纤维素分解菌进行体外筛选及培养，对纤维素进行开发，使其可在体外对饲料进行有效分解，提升草牧的使用价值。

1材料与方法

1.1材料

选取西藏地区的10头黄牛，对黄牛瘤胃微生物进行检测，选取4头黄牛对其进行瘤胃瘘管手术，4头黄牛中公母各2头，且属于成年黄牛，年龄2-4岁。

1.2药品及仪器

选取百泰克生物公司研制的RNA提取的纯化试剂盒、日本Mit-subishi公司研制的氧气指示剂、微需氧气生产袋、密封培养管7.0L、厌氧产气袋、SIGMA公司研制的DEPC、法玛西亚公司研制的尼龙膜、北京江晨生物研究中心研制的其他药品。上海生物技术有限公司研制的地高辛标记引物[1]。

1.3饲料

依照西藏农牧业现有饲料特点和西藏当地黄牛营养代谢情况，对于饲料配方进行确定，饲料由兰州大学负责配置，分别于每天上午9：00、下午6：00对黄牛进行喂养，除喂养饲料外，还需进行水、添加剂的喂养，饲料配方中粗饲料占绝大部分比例，并且在夜间不再进行喂养。选取的试验黄牛根据其体重进行喂草，将精料依据配方比均匀拌至水中，除上午9：00、下午6：00外，其余时间均以草料为主。

1.4测定可溶性糖及不同态N

选取蒽酮法对可溶性糖进行测定，选取半微量凯氏定氮法对不同态N进行测定，不同态N包括全N、N03--N、NH4+-N。

1.5细菌培养基

厌氧细菌培养基经过分离并改良后，培养基涵盖0.5g酵母膏、0.1g浓度为1%的刃天青溶液、0.2g肉膏、1g胰蛋白胨、1.5g琼脂，灭菌瘤胃液与无菌水的比例为1：1，剂量为78mL，把以上物质均匀溶于混合液中，随后加入2g葡萄糖、5mL浓度为8%Na2CO3、1g浓度为0.07%氯高铁血红素、pH值为7.0、1mL浓度为3%盐酸半胱氨酸，并向混合液中加入CO2。

选取厌氧袋进行厌氧培养，羧菌选取的培养基经过筛选并改良后，培养基涵盖1g淀粉、1.5g酵母膏、5g醋酸钠、10g蛋白质、10g牛肉膏、1g葡萄糖、15g琼脂、0.5gL-半胱氨酸、灭菌瘤胃液与无菌水的比例为1：1，剂量为500mL，pH值为7.1-7.2，进行灭菌操作后，在混合液中加入1mL浓度为10%的NaC1、500mL浓度为5%的Na2S、柠檬酸铁混合液浓度为7%。

2结果

2.1纤毛虫数量变化特征值

改造黄牛血细胞计数板，并对瘤胃原液利用甲基绿甲醛液进行稀释，分别对选取的10头黄牛纤毛虫数量在瘤胃液中的情况及24h内纤毛虫数量变化情况进行分析，共发现纤毛虫12种，数量特征值为毛头虫占总纤毛虫的70.4%-72.5%。黄牛瘤胃液中24h内纤毛虫变化情况：上午10：00至下午2：00，由于黄牛瘤胃液排空且大量进食，纤毛虫数量有所下降;下午2：00-6：00，即喂养精料和水前，由于黄牛喂食减轻，纤毛虫数量有所增加。因此，可得出纤毛虫数量与黄牛食用饲料有直接关系[2]。纤毛虫在上午喂食精料及饮水后，伴随黄牛瘤胃液排空数量显著下降，随后又由于喂食及养分增加，纤毛虫数量有明显上升。

2.2细菌数量变化特征值

在特殊培养基改良、分离、培养的作用下，对真菌及细菌进行计数，选取地高辛标记法对真菌及细菌进行杂交。结果显示，细菌数量变化情况和纤毛虫数量变化情况保持一致，细菌在上午喂食精料及饮水后数量下降，在喂食精料和水前有所增长，与黄牛瘤胃内物质养分组成相同。

3讨论

在黄牛瘤胃中可溶性糖90%在微生物的作用下，被发酵分解为CO2及VFA，且有能量生成，为微生物繁殖提供条件，瘤胃内蛋白质分解菌占总数的12%-18%。由此可知，导致N源及可溶性糖出现变化的因素为黄牛喂食的时间以及食物停留于黄牛瘤胃中的时间。对于黄牛喂养时间及形式详细进行介绍，N源的消化时间分别在喂食精料、上午采食前以及喂食精料前、停止采食后，此段时间由于瘤胃物质更新速度较慢，因此瘤胃内N源得以消化。喂食精料后2h内，可溶性糖出现最高值，此时淀粉分解量达最大。普遍微生物分泌的复合酶促进纤维素进行分解，复合酶涵盖胞外酶及胞内酶，在二者的共同作用下，纤维素先行分解为多糖分支较少，随后分解为二碳糖，在酶水解的作用下，纤维二糖分解为葡萄糖，此时糖量值处于稳定状态，在试验中可溶性糖共有2个高峰值，且均是喂食精料后，微生物分解2-3h内生成淀粉[3]。

饲养草料中的营养成分直接影响纤毛虫的数量，由于西藏地区草料营养价值略低、纤维素含量较高，在纤维素降解中由于瘤胃真菌、细菌、原虫的存在，导致半纤维素及纤维素均被降解。但瘤胃中其余微生物无法对半纤维素及纤维素进行直接降解。瘤胃内纤毛虫总数为每毫升1.5×206～8.6×206。纤毛虫在西藏黄牛体内主体为毛虫科，而纤毛虫属于毛虫科，主要依靠纤维素生存，密毛虫在均毛虫科中占较大比例，占总体的5.4%-6.9%。而内毛虫又在毛虫科中占绝大比例，约占总体的70.9%。纤毛虫在瘤胃中的数量以及变化情况受黄牛喂食时间、饲料营养成分组成以及食物停留在瘤胃中时间的影响。黄牛在上午12：00至晚上8：00会大量消耗摄取到的食物，伴随瘤胃内物质的排空，纤毛虫数量有所下降，在下午黄牛停止喂食时，纤毛虫数量达至最大，此时，纤毛虫得以大量繁殖，纤毛虫总数可达1.5×106/mL。

4结论

黄牛瘤胃中微生物数量及种类较多，其中包含大量的真菌、细菌以及虫类，通过对瘤胃中的纤毛虫数量、细菌数量进行研究分析，得出影响其数量及变化规律的因素，但由于黄牛瘤胃内微生物生态系统极具复杂性，本文仅是对于其中的几点微生物进行探究，不具备完善性，因此，还需有关人员对其进行更深一步的研究。

参考文献

[1]朱昊鹏，郑月，颜培实.精料补饲水平对锦江黄牛生长性能和瘤胃液理化指标的影响[J].畜牧与兽医，2017，49（3）：24-29.

[2]魏园，赵晨旭，李心慰，等.不司粗纤维源口粮对梅花鹿瘤胃微生物区系的影响[J].中国兽医学报，2018，38（1）：217-221.

[3]李君风，原现军，蕈志浩，等.西藏地区牦牛瘤胃中兼性厌氧纤维素降解菌的分离鉴定[J].草业学报，2017，26（6）：176-184.

作者简介：巴桑珠扎（1979-），男，藏族，西藏拉萨人，就职于西藏自治区畜牧兽医研究所，主要从事反刍动物遗传育种工作。

通信作者：姜南（1977-），男，汉族，就职于西藏白治区畜牧兽医研究所，主要从事畜禽免疫病理研究工作。