林胜 李强 夏晓峰 尤民生

摘 要：【目的】探究Bt水稻对褐飞虱若虫肠道可培养细菌组成结构的影响，为转基因水稻的安全性评价提供科学依据。【方法】利用传统微生物纯培养法分别从取食非转基因（CK）水稻和转crylAb抗虫（Bt）水稻的褐飞虱肠道内分离细菌，利用16s rDNA对分离菌株进行鉴定，比较分析转基因水稻对褐飞虱若虫肠道微生物群落结构的影响。【结果】研究结果显示在取食CK水稻和Bt水稻的褐飞虱肠道内各分离获得7株细菌。取食CK水稻的褐飞虱肠道细菌分别属于3个门5个属;而取食Bt水稻的褐飞虱肠道细菌分别属于2个门4个属;分离获得频率最高的是变形菌门细菌Proteobateria，其中取食两种水稻均能分离获得变形菌门的泛菌属Pantoea，以及厚壁菌门Firmicutes的葡萄球菌属Staphylococcus等2个属的细菌。取食CK水稻的褐飞虱肠道内分离获得变形菌门的草螺菌属Herbaspirillum和不动杆菌属Acinetobacter，以及放线菌门的微杆菌属Microbacterium等3个特异性细菌属;取食Bt水稻的褐飞虱肠道内分离得到变形菌门的肠杆菌属Enterobacter和伯克氏菌属Burkholderia等2个特异性细菌属。【结论】取食非转基因水稻和转基因水稻的褐飞虱肠道可培养细菌组成存在一定的差异。本研究为后续深入研究褐飞虱肠道共生细菌的功能，以及转基因水稻对非靶标生物肠道细菌的影响提供了材料和基础。

关键词： 褐飞虱;转基因水稻;肠道细菌;非靶标效应;生物安全

中图分类号：S 663.4文献标识码：A文章编号：1008-0384（2019）07-802-08

Abstract：【Objective】 The present study aims to explore the effects of Bt rice on gut bacterial structure of the Nilaparvata lugens nymphae and to provide evidence for rational safety assessment of Bt rice. 【Method】 Gut bacteria from BPH feeding on non-transgenic rice （CK） and transgenic rice （Bt） were isolated using traditional culture methods， and were identified using 16s rDNA. The composition of isolates was compared between these two treatments. 【Results】 The results showed that seven bacterial strains were isolated from the gut of N. lugens feeding on either CK or Bt rice. Three phyla and five genera of the gut bacteria were identified from N. lugens feeding on CK rice， while two phyla and four genera of the gut bacteria from N. lugens feeding on Bt rice. The taxa of bacteria identified from the guts of N. lugens either feeding on CK rice or Bt rice were Proteobateria （including the genus of Pantoea） and Firmicutes （including the genus of Staphylococcus）. Herbaspirillum Acinetobacter and Microbacterium were specific genera from the CK treatment， while Enterobacter， and Burkholderia from the Bt treatment. 【Conclusion】 The composition of culturable bacteria in the N. lugens gut was different beween the CK treatment and the Bt treatment. The findings provide an important foundation for further studies on the function of symbiotic bacteria in N. lugens， and the effects of transgenic rice on the gut bacteria of non-target species.

Key words：Nilaparvata lugens; genetically modified rice; gut bacteria; non-target effect; biosafety

0 引言

【研究意義】自1989年抗虫Bt水稻首次研制成功，近年来，我国Bt水稻的研发得到了迅速的发展[1]。目前，我国正式获得国家安全证书的抗虫转基因水稻品种仅有两种，分别为华恢1号和Bt 汕优63，于2009年首次获得，到期后于2014年重新获得安全证书，但仍未批准可以进行商业化种植[2]，这其中很大一部分原因是这些转基因抗虫水稻的环境安全问题还未明确。褐飞虱Nilaparvata lugens（Brown planthopper， BPH）是稻田常见的一种害虫，其虫体小、繁殖快、易于迁飞，极易爆发成灾。自1980年以来，我国每年受褐飞虱危害的水稻面积约占水稻种植总面积的一半，约1 330万～2 000万hm2，由此造成稻谷产量直接损失达到10亿～15亿kg [3-4]。研究转Bt水稻对褐飞虱肠道细菌结构的影响，可为全面评价转基因水稻的安全性提供参考。【前人研究进展】关于转基因抗虫水稻的环境安全问题，已有的研究主要包括转基因抗虫水稻对生态系统生物多样性的影响（包括节肢动物和土壤微生物）、对靶标害虫的抗性影响、对非靶标生物（包括非靶标害虫、天敌、传粉昆虫、中性昆虫等）的安全性等[5-9]。【本研究切入点】迄今的研究很少关注转基因抗虫水稻对非靶标生物肠道共生微生物的影响，目前仅发现一篇文献报道利用Biolog-Eco方法检测转cry1Ab粳稻对褐飞虱肠道微生物多样性的影响[10]。肠道共生微生物在昆虫的食物消化、营养利用、生长发育和生殖调控及抵御病原物和有害物质的过程中发挥着重要的作用 [11-12]，同时在昆虫免疫、影响杀虫剂抗性 [13-15]以及信息素的合成 [14，6]等方面也起到重要的作用。【拟解决的关键问题】利用传统细菌培养方法结合分子鉴定技术，分析取食转基因Bt水稻对非靶标害虫褐飞虱肠道细菌结构的影响，研究结果将有助于进一步明确Bt水稻的环境安全性。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 供试水稻 转crylAb抗虫水稻（株系mf-MH3301）（简称Bt水稻）及其亲本对照非转基因水稻闽恢3301（简称CK水稻）由福建省农业科学院农业遗传工程重点实验室提供。转cry1Ab抗虫水稻品种通过农杆菌介导将双T-DNA载体pCDMARUBb-Hyg转化优良水稻恢复系闽恢3301，并通过多代自交、检测与选择，获得无选择标记转cry1Ab抗虫基因水稻纯合株系，cry1Ab基因已整合到受体植物的染色体上，并且可稳定地遗传和表达。

1.1.2 供试昆虫 供试褐飞虱系2011年由福建农林大学病毒研究所提供虫源，饲养于福建农林大学应用生态研究所人工气候室中，褐飞虱分别饲养在Bt水稻和CK水稻上，至今已在实验室中连续饲养5年，饲养条件：温度（27±2）℃，光照L∶D=14∶10，光强度3 500～4 000 lx，相对湿度60%～70%。

1.1.3 供试培养基 每升培养基中的有效成分及其含量如下，所有培养基均调节pH至7.0，于121℃高压灭菌20 min，备用。

LB培养基：5 g酵母抽提物，10 g NaCl，10 g蛋白胨，15 g琼脂;高氏一号培养基（G）：20 g可溶性淀粉，15 g琼脂，1 g KNO3，0.5 g K2HPO4，0.5 g MgSO4·7H2O，0.5 g NaCl，0.01 g FeSO4·7H2O;营养琼脂平板（NA）：3 g牛肉膏，5 g NaCl，10 g蛋白胨，15 g琼脂;沙门菌培养基（SS）：5 g牛肉膏粉，5 g蛋白陈，15 g琼脂，3.5 g三号胆盐，10 g乳糖，8.5 g柠檬酸钠，8.5 g硫代硫酸钠，1 g柠檬酸铁，0.025 g中性红，0.000 33 g煌绿。

1.2 试验方法

1.2.1 褐飞虱肠道解剖 分别取饲养在Bt水稻和CK水稻上的褐飞虱4～5龄若虫100头，用冰使其昏迷，用75%乙醇对虫体进行表面消毒处理，再用无菌双蒸水清洗数次。在解剖镜下用解剖镊子去除头部，然后夹住褐飞虱头胸部和腹部末位置，轻轻将肠道以及内脏器官拉出，用无菌双蒸水漂洗，去除其他内脏器官，取出肠道放置于装有200 μL PBS缓冲液（pH 7.0）的1.5 mL离心管中，将灭过菌的钢珠置于离心管中于组织破碎仪上进行破碎匀浆。

1.2.2 褐飞虱肠道细菌的分离培养 将上述提取的肠道匀浆按照10-1、10-2、10-3进行稀释，分别涂布于LB、NA、G和SS平板上，每种培养基平板3次重复。随后，将平板置于37℃培养箱中倒置培养24～30 h，分别挑选大小、颜色、形态不一的单菌落于LB培养基中纯化5代。

1.2.3 16S rDNA基因的扩增 单克隆菌株基因组DNA提取采用细菌基因组DNA提取试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]进行。以提取的总DNA为模板，细菌16S rDNA通用引物27F（5′-AGA GTT TGA TCC TGG CTC AG-3′）和1492R（5′-GGT TAC CTT GTT ACG ACT T-3′）进行肠道细菌16S rDNA的扩增 [17-18]。PCR反应体系为25 μL，包括50 ng DNA模板，1×EasyTaqSuperMix，5 pmol 引物PCR反應条件为：94℃预变性 5 min;30次循环，每次循环包括94℃变性30 s，62℃退火30 s和72℃延伸1 min;最后72℃再延伸10 min。扩增产物采用1.0%的琼脂糖凝胶电泳进行检测，检测阳性的产物送至上海铂尚生物技术有限公司进行测序。

1.2.4 褐飞虱肠道细菌系统发育分析 运用NCBI提供的Blast工具，将测序得到的16S rDNA序列与NCBI GenBank数据库进行Blast比对，对所得菌种的DNA序列进行同源性搜索，获得相似序列，利用MEGA6.0软件进行序列比对以及进化树的构建[19]，进化树的构建方法采用邻位相连（Neighbor-Joining）算法[20]，利用Bootstrap来检验系统发育树的可靠性。

2 结果与分析

2.1 褐飞虱肠道细菌的分离鉴定

取食CK水稻的褐飞虱肠道共分离得到7株单一菌落，其中CK1的菌落颜色为橘黄色，较黏稠，不易挑取;CK2、CK5和CK6的菌落形态颜色较为相近，颜色为浅黄色;CK3在LB与SS培养基上均有生长，颜色浅黄白色;CK4生长在LB培养基上，生长较为缓慢，数量少;CK7菌落浅黄白色（图1）。取食Bt水稻的褐飞虱肠道也分离得到7株单一的细菌菌落，其中Bt5菌落呈现橘黄色颜色较深，Bt3、Bt6、Bt7均为浅黄色比较相近，Bt2、Bt4为白色菌落（图2）。

2.2 分离菌株的16S rDNA鉴定

以上述14株菌株的基因组DNA为模板扩增16S rDNA（图3、4）。将回收的PCR产物进行测序，测序结果提交至GenBank。取食CK水稻的褐飞虱肠道细菌CK1-CK7的序列号为KU863620-KU863626;取食Bt水稻褐飞虱的肠道细菌Bt1-Bt7的序列号为KU863627-KU863630及KU867651-KU867653。Blast比对结果表明，CK1和CK5属于泛菌属Pantoea，CK3属于不动杆菌属Acinetobacter，CK7属于草螺菌属Herbaspirillum，它们均属于变形菌门Proteobacteria;CK2和CK6属于厚壁菌门Firmicutes葡萄球菌属Staphylococcus;CK4属于放线菌门Actinobacteria微杆菌属Microbacterium（表1）。Bt1属于肠杆菌属Enterobacter，Bt3和Bt6属于伯克氏菌属Burkholderia，Bt7属于泛菌属Pantoea，它们均属于变形菌门Proteobacteria;Bt2、Bt4和Bt5属于葡萄球菌属Staphylococcus，它们均属于厚壁菌门Firmicutes（表1）。

2.3 系統发育分析

褐飞虱肠道细菌16S rDNA序列系统发育分析结果表明，取食CK水稻的褐飞虱肠道细菌形成3个家族的分支，其中CK1、CK3、CK5、CK7形成一个以变形菌门Proteobacteria为家族的大分支，CK2、CK6形成以厚壁菌门Firmicutes为家族的分支，CK4单独形成分支归属于放线菌门Actinobacteria（图5）。在取食Bt水稻的褐飞虱肠道细菌中，形成2个家族的分支，其中Bt1、Bt3、Bt6、Bt7形成一个以变形菌门Proteobacteria为家族的大分支，Bt2、Bt4、Bt5形成一个以厚壁菌门Firmicutes为家族的分支（图6）。

3 讨论与结论

昆虫肠道中集聚着大量的微生物，在长期的进化过程中昆虫肠道微生物与宿主发展出紧密的共生关系，对宿主的生长发育、抵御病原菌等起着重要的作用 [21-22]。肠道微生物群落的丰富度和群落结构功能的多样性是衡量昆虫肠道是否健康的一个重要指标 [23-24]。因此，评价Bt水稻对非靶标褐飞虱肠道微生物的影响，可以从另一个视角为探明Bt水稻的非靶标效应提供科学依据。

本研究借助传统微生物分离纯化技术分析了褐飞虱取食非转基因和转基因水稻后，其肠道内的细菌种类差异。尽管本研究获得的菌株数量较少，但却可以看到不同食物对肠道细菌的种类分布具有一定的影响，而高秀云等用Biolog-Eco方法分析认为，转cry1Ab粳稻（KMD1/KMD2）对非靶标害虫褐飞虱肠道微生物群落多样性没有明显的负面影响[7]。本研究从取食CK水稻和Bt水稻的褐飞虱肠道内共分离获得14株细菌，其中从取食两种水稻的褐飞虱肠道内均能分离获得2个属的细菌，分别为变形菌门的泛菌属Pantoea和厚壁菌门的葡萄球菌属Staphylococcus。另外，取食CK水稻的褐飞虱肠道内分离得到3个特异性细菌属，分别为变形菌门的草螺菌属Herbaspirillum和不动杆菌属Acinetobacter，以及放线菌门的微杆菌属Microbacterium;取食Bt水稻的褐飞虱肠道内分离得到2个特异性细菌属，分别为变形菌门的肠杆菌属Enterobacter和伯克氏菌属Burkholderia。当前结果提示取食Bt转基因水稻有可能影响肠道可培养菌群的结构和多样性，但其结果仍需要进一步通过更大规模的培养，同时结合高通量测序来验证，该研究为未来进一步开展转基因水稻对昆虫肠道细菌的影响提供了依据。

在取食两种水稻的褐飞虱肠道细菌中，分离频率最高的菌均为变形菌门细菌，该结果与已有研究一致，例如学者对半翅目昆虫点蜂缘椿象Riptortus clavatus肠道微生物的研究发现，变形菌门的Burkholderia属在其中后肠腔中所占比例达95%以上[25]，同样在鳞翅目棉铃虫[26]、家蚕[27]、小菜蛾[28]等肠道中均发现其肠道内的优势菌为变形菌门。本研究在对取食Bt水稻的褐飞虱肠道细菌的分析中，未发现放线菌门细菌，Bt蛋白是否会影响放线菌门的细菌有待进一步研究验证。

本研究通过传统的微生物培养方法分离鉴定褐飞虱若虫肠道细菌，为后续的功能研究提供了菌体材料。已有研究表明，实验室内可培养菌所占的比例不足自然界中微生物的1%[29]，所以肠道内低丰度以及不可培养菌很难通过传统的培养方法进行分离鉴定。利用分子生物学技术可以很好地解决上述问题，尤其近几年高通量测序技术的飞速发展，能够高灵敏度地定量昆虫肠道内微生物，如王天召等利用高通量测序技术探明了褐飞虱成虫肠道微生物群落结构和多样性[30]。因此，下一步工作可以考虑利用高通量测序技术检测转基因水稻对褐飞虱肠道微生物多样性和功能的影响。

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（责任编辑：林海清）