刘朝圣 申梦洁 韩晓凤 彭丽丽 刁庆春

〔摘要〕 目的 研究红景天苷对中波紫外线（ultraviolet B， UVB）辐射HaCat细胞增殖及Caspase-3、Caspase-9蛋白表达的作用。方法 将HaCat细胞分为6组：即正常对照组（Ⅰ组）、红景天苷中剂量组（Ⅱ组）、UVB辐射组（Ⅲ组）、UVB+红景天苷低剂量组（Ⅳ组）、UVB+红景天苷中剂量组（Ⅴ组）、UVB+红景天苷高剂量组（Ⅵ组），Ⅰ组未经任何处理，Ⅱ组加入40 μg/mL的红景天苷，Ⅲ组接受200 mJ/cm2剂量紫外线照射，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组分别加入10、40、80 μg/mL红景天苷并进行200 mJ/cm2紫外线照射。HaCat细胞培养24 h后，采用MTT法检测细胞活力，流式细胞仪观察细胞周期，Western blotting法检测Caspase-3、Caspase-9表达的蛋白水平。结果 MTT结果显示随着红景天苷浓度的增加，HaCat细胞的生存率逐渐增加;流式细胞仪检测细胞周期显示HaCat细胞的S峰值随着红景天苷浓度的增加呈现上升趋势，Ⅵ组S峰值高于Ⅱ组;Western blotting显示Ⅵ组Caspase-3/9的蛋白表达量均有下降。结论 红景天苷可通过抑制Caspase-3和Caspase-9蛋白表达，减少UVB诱导HaCat细胞凋亡。

〔关键词〕 红景天苷;中波紫外线;细胞增殖;Caspase-3;Caspase-9

〔中图分类号〕R285.5;R818       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.005

〔Abstract〕 Objective To investigate the effects of Salidroside on proliferation and expression of Caspase-3/9 protein in HaCat cells induced by ultraviolet B （UVB） radiation. Methods HaCat cells were divided into 6 groups： a normal control group （group I）， a medium dose of Salidroside group （group II）， a UVB radiation group （group III）， a UVB+ low dose of Salidroside group （group IV）， a UVB+ medium dose group （group V）， a UVB+ high dose of Salidroside group （VI group）. Group I was not treated. Group II was added with 40 μg/mL of Salidroside; Group III was irradiated with ultraviolet radiation at 200 mJ/cm2; Group IV， Group V， Group VI were added with 10 μg/mL， 40 μg/mL， 80 μg/mL of Salidroside respectively and irradiated with 200 mJ/cm 2 doses of ultraviolet. After 24 hours of HaCat culture， cell viability was detected by MTT assay， and cell cycle was observed by flow cytometry. The protein levels of Caspase-3 and Caspase-9 were detected by western blotting. Results The results of MTT showed that the survival rate of HaCat cells was increased with the increase of Salidroside concentration. Flow cytometry suggested the S peak of HaCat cells increased with the increasing concentration of Salidroside. The S peak of group VI was higher than that of Group II. Western blotting revealed that the protein expression of Caspase-3/9 decreased in the Salidroside group with high concentration. Conclusion Salidroside can reduce HaCat cell apoptosis induced by UVB through inhibiting the expression of Caspase-3 and Caspase-9 protein.

〔Keywords〕 Salidroside; ultraviolet B; cell proliferation; Caspase-3; Caspase-9

多数天然产物含有抑制细胞凋亡作用的成分，红景天作为一种常用的高原中药材，其主要有效成分包括红景天苷、酪醇及红景天多糖等，其中红景天苷是从大株红景天的干燥根及根茎或干燥全草中提取的主要有效成分，现代药理学研究证实，红景天在皮肤科的应用中具有抗衰老[1]、防光老化[2]、抗菌[3]、抗辐射等多种活性作用，且副作用较小[4]。本文研究了不同浓度红景天苷对中波紫外线（ultraviolet B， UVB）辐射HaCat细胞的增殖活性及对内源性凋亡途徑中的凋亡因子Caspase-3、Caspase-9蛋白水平的影响，探讨其抗辐射机制，现将结果报道如下。

1 材料与方法

1.1  材料

1.1.1  材料与试剂  DMEM培养基（Gibco公司），二甲基亚砜（Sigma公司），MTT溶液（Amresco公司），嗅化乙锭（PI）染液、RNA酶、胎牛血清（均来自永捷实验室），青霉素、链霉素、0.25%胰蛋白酶、三羟甲基氨基甲烷（Tris）、RIPA裂解液、BCA试剂盒（均来自碧云天生物技术研究所），兔抗人Caspase-3一抗、兔抗人Caspase-9一抗、鼠抗人β-actin一抗（均来自Abcam公司），HRP（辣根过氧化物酶）标记的羊抗鼠IgG二抗、HRP标记的羊抗兔IgG二抗（均来自Sant Cruz公司），ECL发光试剂盒（美国Thermo Scientific公司）。人类永生化角质形成细胞株（HaCat细胞）由重庆市第一人民医院皮肤科实验室保存并提供;红景天苷（每支20 mg，批号：H-040-141103）购自中国四川成都瑞芬思生物科技有限公司，實验中用灭菌蒸馏水按所需浓度溶解配制。

1.1.2  主要仪器  311窄谱UVB治疗仪（深圳半岛医有限公司），DNM-9602G酶标仪分析仪（北京普朗公司），流式细胞仪（美国 Bio-Rad 公司），Model Universal Hood Ⅱ凝胶成像系统（美国 Bio-Rad 公司），电泳仪、电转槽、摇床（上海一恒）等。

1.2  实验方法

1.2.1  细胞培养  HaCat细胞采用细胞生长液（高糖DMEM、10%FBS、青霉素100 U/mL以及链霉素100 ？滋g/mL），于5% CO2、37 ℃细胞孵育箱中孵育。培养过程中，维持细胞密度在70%～90%的状态，依细胞生长状态3～4 d传代1次。经过2次传代后，择其生长旺盛、状态良好的细胞进行分组实验。

1.2.2  细胞分组及处理  调整HaCat细胞悬液浓度为（8～10）×104/mL，每孔1 mL接种在6孔板中，90%融合后进行药物干预处理及紫外线照射。分成6个组进行实验。正常对照组（下称Ⅰ组）：普通培养基培养，不进行紫外线照射;红景天苷中剂量组（40 μg/mL，下称Ⅱ组）无紫外线照射;UVB辐射组（下称Ⅲ组）：无任何试剂，紫外线照射;UVB+红景天苷低剂量组（10 μg/mL，下称Ⅳ组）进行紫外线照射;UVB+红景天苷中剂量组（40 μg/mL，下称Ⅴ组）进行紫外线照射;UVB+红景天苷高剂量组（80 μg/mL，下称Ⅵ组）进行紫外线照射。

紫外线照射方法：将培养细胞置于距离紫外光光源垂直距离为2 cm的地方（每孔加入2 mL PBS），照射功率为200 mJ/cm2，照射时间为30 s。UVB照射后再常规培养24 h，取培养细胞进行相关指标检测。

1.3  检测指标及方法

1.3.1  四唑盐（MTT）比色法检测各组细胞生存率  将细胞以1×104/mL接种到96孔板中，每孔100 μL，待细胞贴壁后，去除原培养液，进行实验分组并增设空白组，每组3个复孔。96孔板中细胞经UVB辐射后24 h，各孔中加入5 mg/mL MTT 10 μL至MTT的终浓度为0.5 mg/mL，孵育箱中培养4 h，弃上清，每孔加入100 μL二甲基亚砜（DMSO）进行溶解，室温下摇床震荡5 min，使甲瓒结晶完全溶解，用自动酶标仪测定490 nm处吸光度A值，计算存活率。每组取各复孔的平均值，以空白组吸光度值调零。实验重复3次。

存活率=（A值处理组-A值阴性对照组）/（A值阳性对照组-A值阴性对照组）×l00%

1.3.2  流式细胞仪（FCM）检测细胞周期  收集各组实验细胞，PBS清洗2次。用提前预冷的75%乙醇4 ℃过夜固定细胞，离心（3 000 r/min，5 min），弃上清，PBS清洗2次，并离心（3 000 r/min，5 min）弃上清，每个样本加入80 μL的50 μg/mL RNA酶，37 ℃孵育30 min后，加入100 μL的50 μg/mL的嗅化乙锭（PI）染液，混匀，室温避光孵育10 min后，液体经100 μm滤网膜过滤后上机检测细胞周期，经仪器自带软件处理直接得出细胞增殖活性。

1.3.3  Western Blotting方法测定Casepase-3/9蛋白表达  使用PIPA细胞裂后按产品试剂盒说明用 BCA法检测蛋白浓度，取等量的蛋白样品（40 μg）经10% SDS-PAGE分离胶和80 V恒压电泳分离后，转印至PVDF膜上，5%脱脂奶粉加PBST配置成封闭液室温封闭2 h，加入鼠抗人β-actin 一抗按1∶5 000 BSA稀释，兔抗人 Caspase3/9 一抗按1∶1 000 BSA稀释，4 ℃摇床摇动孵育封闭过夜;TBST（H2O+TBS+Tuween20）洗涤3次（每次10 min）后，加入1∶2 000稀释的HRP标记羊抗鼠或羊抗兔二抗，在室温下孵育1 h，TBST再次洗膜3次（每次10 min），小心吸净洗膜液后加入ECL发光底物，关闭电源，在凝胶成像系统中成像、摄图。重复3次。应用Quantity One软件对红景天苷蛋白的相对表达量进行分析，测定图片上每个特异条带的灰度值，用目的蛋白的灰度值/内参β-Actin的灰度值，所得结果为目的蛋白相对含量。

1.4  统计学方法

采用SPSS 20.0软件进行统计分析，定量资料以“x±s”表示，多组数据比较采用单因素方差分析（One-Way ANOVA）;以P<0.05差异具有统计学意义，P<0.01差异有显著统计学意义。

2 结果

2.1  MTT法检测细胞的生存率

如表1所示：与Ⅰ组比较，UVB照射对HaCat细胞的存活率有统计学意义（P<0.05），相同剂量的UVB照射条件下随着红景天苷的浓度增加HaCat细胞的OD值呈逐渐上升趋势，10、40、80 μg/mL红景天苷组的生存率分别为（75.37±13.45）%、（80.87±11.12）%、（84.65±9.22）%，与Ⅱ组、Ⅲ组比较，差异均有统计学意义（P<0.05）。

2.2  流式细胞仪检测细胞周期比较增殖活性

利用PI染色法结合流式细胞仪观察对HaCat细胞周期的影响， 根据ModFit软件分析得到实验数据，如图1、表2所示：在G0/G1期，与Ⅰ组比较，Ⅲ组的细胞含量（56.68±0.011）%为最高，差异有统计学意义（P<0.05）;与Ⅱ组比较，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组差异有统计学意义（P<0.05），且随着红景天苷的浓度增加，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的细胞分裂数量逐渐下降;与Ⅲ组相比较，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组差异有统计学意义（P<0.05），且在相同条件下UVB照射后，随着红景天苷的浓度增加，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组细胞的活跃度呈上升趋势。在S期，Ⅰ组细胞活性明显高于Ⅲ组，差异有统计学意义（P<0.05）;与Ⅲ组比较，在相同条件下UVB照射后，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组细胞活性明显增加，差异有统计学意义（P<0.05），且随着红景天苷的浓度增加细胞的活跃度呈上升趋势，Ⅵ组HaCat细胞活性值最高。在G2/M期，与Ⅲ组比较，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组的凋亡细胞数量呈现逐渐下降趋势，差异有统计学意义（P<0.05）。

2.3  Western Blotting方法测定Casepase-3、Casepase-9蛋白表达

从Caspase-3、Casepase-9的蛋白表达来看，与Ⅰ组比较，Ⅲ组的表达量均明显高于Ⅰ组，差异具有统计学意义（P<0.05）;与Ⅱ组比较，Ⅳ、Ⅴ、Ⅵ组差异有统计学意义（P<0.05）;各实验组Caspase-3、Casepase-9随着红景天苷浓度的增加，蛋白表达量逐渐下降，尤以高浓度红景天苷组（Ⅵ组）下降最为明显，与Ⅲ组比较差异均有统计学意义（P<0.05）。结果表明低浓度（10 μg/mL）的红景天苷对HaCat细胞的防护作用最差，而高浓度的红景天苷组对HaCat细胞有一定的抑制凋亡的作用。见图2、表3。

3 讨论

日常生活中的UVB照射可诱使皮肤出现光老化、免疫抑制改变及发生皮肤癌变等。这些变化与UVB照射后细胞内产生数量较多的氧自由基（reactive oxygen specie，ROS）有关，它可以引起皮肤表皮及真皮细胞内的DNA损伤，从而导致皮肤癌的发生，因此如何防护其损伤显得尤为重要。从天然植物和传统药物中开发新型抗辐射药具有高效和低毒副作用等优点。

红景天是景天科红景天属多年生草本或亚灌木植物，《四部医典》中记载它具有扶正固本，理气养血，滋补强身之功效，藏族人民称之为“雪域仙草”。红景天多生长在海拔4 000多米的雪域高原上，其高原地属紫外线辐射强烈地带，故在雪域高原上生长的植物大部分都具有抗紫外线的特性。近几十年来，国内已经研发含有红景天成份的各类护肤产品，但其美白、抗氧化、防辐射等作用机制研究仍不够明确，因此值得大家深入研究。

Caspase家族属于介导细胞凋亡的一大类调节基因，是细胞凋亡的启动和执行者，是凋亡信号传导的共同通路。其中Caspase-9位于Caspase级联反应的最上游，能在其它细胞因子的参与下发生自我活化并激活下游执行型Caspase，如Caspase-3，后者可特异性地裂解底物使细胞发生生化及形态学改变，最终导致细胞凋亡[5-7]。有相关药理学研究表明红景天苷可通过调节Bax/Bcl-xl通路[8]、纹状体中DA、DOPAC和HVA的水平[9]，或者抑制慢性缺氧诱导的PASMCs增殖[10]、增加Bax/Bcl-2比例[11]，或者抑制Caspase-3、Caspase-8、caspase-9活化等多种不同路径，从而诱导细胞进行凋亡[12]。有研究证明红景天苷可发挥抗多系统细胞氧化及细胞衰老的作用[13]，抗炎抗肿瘤，保护血管等[14-17]。本实验在临床观察基础上，从细胞凋亡角度探讨红景天抗辐射作理机制。

本实验结果表明，不同浓度的红景天苷的均能提高HaCat细胞存活率，增加细胞分裂活性，且呈浓度依赖性趋势。在相对蛋白表达中，细胞因子Caspase-3、Caspase-9中UVB组（Ⅲ组）蛋白含量明显高于其他各实验组，而不同浓度的红景天苷组 Caspase-3、Caspase-9相对蛋白表达均下调，尤以高浓度的下降最明显，结果与张伟等[18]、史飞等[19]、饶燕等[20]相关研究报道基本一致。这表明红景天抗紫外线辐射的作用机制可能是通过下调凋亡级联因子从而减少细胞的凋亡水平而实现，本研究为红景天在临床应用和产品研发提供了一定实验依据。

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