刘蓉芳 毛以林 谭雄 张辉 毛湘屏 杨柳 陈志成

〔摘要〕 目的 探讨心康冲剂对心衰大鼠Caspase-3、Caspase-9表达的调控作用。方法 58只SD大鼠分为正常组10只，模型组、心康组及对照组各16只，造模完后，心康组给予心康冲剂溶液0.5 g/kg灌服，对照组予芪苈强心胶囊溶液0.06 g/kg灌服。采用心脏彩超检测心功能;心脏切片行TUNNEL染色法观察心肌细胞凋亡;心肌组织采用Real-time PCR法及免疫组化法检测Caspase-3、Caspase-9基因及蛋白质表达。结果 与正常组比，模型组大鼠Caspase-3及Caspase-9的mRNA与蛋白表达显著增加（P<0.01），TUNNEL染色观察细胞凋亡明显增多;与模型组比较，心康组大鼠心肌凋亡减轻， Caspase-9 mRNA、Caspase-3 mRNA及蛋白明显下降（P<0.01）;与对照组相比，心康组心肌细胞凋亡相对降低，Caspase-3蛋白表达下降（P<0.05）。结论 心康冲剂可调控下调Caspase-3、Caspase-9表达抗心衰。

〔关键词〕 心肌凋亡;Caspase-3;Caspase-9;慢性心衰;心康冲剂

〔中图分类号〕R285.5;R541.6       〔文献标志码〕A       〔文章编号〕doi：10.3969/j.issn.1674-070X.2019.08.004

〔Abstract〕 Objective To investigate the regulatory effects of Xinkang Granule （XKG） on the rats with chronic heart failure （CHF） for the expression of Caspase-3 and Caspase-9. Methods A total of 58 SD rats were randomly divided into a normal group （n=10）， a model group， a XKG group， and a control group， with 16 rats in each group. After the success of the modeling， the XKG group was given XKG solution at 0.5 g/kg， and the control group was given Qili Qiangxin Capsule （QLQXC） solution at 0.06 g/kg. Cardiac function was measured by echocardiography; Heart slices were stained by TUNNEL to observe myocardial apoptosis. The expression of gene and protein of Caspase-3， Caspase-9 were detected by Real-time PCR and immunohistochemistry. Results Compared with the normal group， the gene and protein of Caspase-3， Caspase-9 in the model group significantly increased （P<0.01）. TUNNEL observed significant increase of apoptosis. Compared with the model group， the rats in XKG group showed alleviated myocardial apoptosis， and the Caspase-3， Caspase-9 mRNA and protein expression were significantly reduced （P<0.01）. Compared with the control group， the myocardial apoptosis in the XKG group was relatively decreased， and Caspase-3 decreased （P<0.05）. Conclusion XKG has the function of anti-heart failure by regulating and controlling the expression of Caspase-3 and Caspase-9.

〔Keywords〕 myocardial fibrosis; Caspase-3; Caspase-9; chronic heart failure; Xinkang Granule

多種病理因素（如肾上腺素、血管紧张素Ⅱ、氧化应激、致炎细胞因子、缺血、压力或容量负荷过重、缺氧等）均可使慢性心力衰竭（CHF）诱导出现心肌细胞凋亡[1-2]。心肌凋亡是心衰心脏重构（cardiac remodeling， CR）表现形式之一。由半胱胺酸天冬氨酸酶（Caspases）家族蛋白介导的心肌凋亡途径是内源性凋亡途径，Caspase-3是细胞凋亡的标志[3]，处于凋亡级联上游，传递信号给下游的Caspase-9从而启动凋亡程序，Caspase-3/-9是经典凋亡通路中的两个关键蛋白。

ARB、ACEI类药物是临床抗心肌重构药物，由于其相对适应症、禁忌症导致药物使用有一定局限性，因而探讨安全有效的抗心肌凋亡中药显得尤为迫切。心康冲剂具有健脾渗湿、温阳化气逐水饮的功效，前期研究显示其具有抗慢性心力衰竭[4]，并能改善心肌重构[5-6]。本研究观察心康冲剂调控慢性心力衰竭大鼠Caspase-3、Caspase-9表达，探讨其对慢性心力衰竭大鼠抗心肌凋亡的作用，为治疗心衰提供了新的途径。

1 材料与仪器

1.1  实验动物

58只SPF级SD大鼠，雌雄各半，5周龄，体质量（160±20） g，购于湖南斯克达实验动物有限公司（实验动物合格证号：43004700025096）。

1.2  药品及仪器

盐酸阿霉素（深圳万乐药业），末端脱氧核苷酸转移酶（TdT，上海江莱生物）;actin（1∶4 000，Mouse，美国proteintech），二抗HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Mouse IgG（H+L）（美国proteintech），HRP-conjugated Affinipure Goat Anti-Rabbit IgG（H+L） （美国proteintech），Caspase-3（1∶1 000，Rabbit，美国CST），Caspase-9（1∶200，Rabbit，美国proteintech），TUNNL试剂盒（武汉博士德生物公司），免疫组化二抗试剂盒 PV-9000（北京中杉金桥生物公司），引物（上海生工合成），心康冲剂（湖南省中医院中药制剂室制备）。动物用彩色多普勒超声仪（徐州市大为电子设备有限公司），生物信号采集系统（成都泰盟软件有限公司），LEICA DM LB2型双目显微镜（德国

LEICA），Motic B5显微摄像图像分析系统（麦克奥迪实业集团），BX43型双目生物摄像显微镜（日本Olympus）。

2 方法

2.1  动物分组及造模

取大鼠10只为正常组，余下大鼠48只按1.5 mg/kg剂量腹腔注射阿霉素，每周2次，共注射7周，以左心室短轴缩短率<30%[7]为心衰造模成功，造模方法参考文献[8];再按随机数字表法分为阿霉素对照组（模型组）16只，心康冲剂1倍等效剂量组16只（心康组），芪苈强心胶囊组（对照组）16只。

2.2  药物制备及干预

心康冲剂溶液配制：白参10 g，薏苡仁30 g，大腹皮10 g，黄芪30 g，桔梗5 g，升麻5 g，柴胡5 g，桂枝10 g，茯苓15 g，生姜皮10 g，陈皮10 g，炒白术10 g，制附片10 g，砂仁6 g。经湖南省中医院药剂科制成干燥颗粒后，按成人等效剂量0.5 g/kg配制成浓度为0.6 g/mL的溶液;对照组给予芪苈强心胶囊溶液，按成人等效剂量（0.06 g/kg），配制为浓度0.073 g/mL。大鼠灌胃剂量按人和动物体表面积折算[9]，正常组、模型组予等体积生理盐水灌服，每日1次，连续8周。

2.3  指标及检测方法

2.3.1  心脏超声检测心功能  10%水合氯醛溶液按3 mL/kg麻醉大鼠后前胸脱毛，超声诊断仪取大鼠左心室长轴切面后进行M超声检测，测量左心室短轴缩短率（LVFS）、左室舒张期内径（LVIDd）、左室射血分数（LVEF），所有数据均测量3次并取其平均值记录。

2.3.2  TUNNEL染色法检测细胞凋亡  投入10%多聚甲醛溶液固定的大鼠心脏，先后经石蜡包埋、切片、透明、脱水、PBS漂洗后，50 μL TdT+450 μL荧光素标记后反应10 min。再加50 μL TUNEL反应混合液，PBS漂洗、DAPI染色，封片，观察细胞凋亡情况。

2.3.3  Real-time PCR法检测心肌Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA表达  Trizol法提取大鼠心脏组织总RNA，再行RNA的琼脂糖凝胶电泳。取大鼠左心室心尖部分2 μg，逆转录cDNA，42 ℃孵育15 min，85 ℃孵育5 min离心，冰上冷却，行定量PCR反应。每个样本每个指标3个孔，每孔10 μL。定量PCR扩增条件：95 ℃ 10 min，95 ℃ 15 s，60 ℃ 60 s，40个循环。以2-ΔΔCt反映各样品相对于对照组样品目的基因的表达水平。-ΔΔCt=ΔCt对照组-ΔCt样品，△Ct=△Ct目的-△Ct内参。每个样本重复3次，然后进行统计分析。

在NCBI上搜索获得Caspase-3、Caspase-9基因序列，primer5设计引物，上海生工合成。引物序列见表1。

2.3.4  免疫组化法检测心肌Caspase-3、Caspase-9含量  心肌标本均经4%多聚甲醛液固定、包埋、切片、脱蜡、乙醇脱水后，3%双氧水阻断内源性过氧化物酶;微波修复抗原2次，冷至室温，PBS洗，加1∶100一抗Caspase-3、Caspase-9每片50 μL，4 ℃過夜，加二抗，滴加二甲基联苯胺（DAB）显色液，苏木精复染、脱水、透明、封片。采用MOTIC图像分析系统在×400倍光学显微镜下对Caspase-3、Caspase-9阳性结果进行半定量分析;分析每个视野下各细胞光密度值，最后取该切片总的平均密度值。

平均光密度值=积分光密度值/所选定视野总面积

2.4  统计学方法

所有数据应用SPSS 20.0统计软件进行处理。全部计量资料用“x±s”表示，先检验正态性，如满足正态性，采用单因素方差分析;两两比较，方差齐采用方差分析-LSD检验，方差不齐用Games-Howell 检验;不满足正态性时选择秩和检验。以P<0.05为差异具有统计学意义。

3 结果

3.1  各组大鼠心脏超声结果比较

与正常组比较，模型组心脏扩大而收缩力下降，表现为LVIDd增大，而LVFS、LVEF下降（P<0.01）;与模型组比较，对照组及心康组心腔变小而收缩力增强，LVIDd缩小，LVEF、LVFS升高（P<0.05，P<0.01）;与对照组比较，心康组LVEF升高（P<0.05）。见表2。

3.2  TUNNEL法观察细胞凋亡

400×光镜下观察：正常组细胞核排列规整、呈蓝色长梭形。造模后，模型组棕褐色坏死颗粒物质明显增多;与模型组相比，心康组棕褐色坏死颗粒物质则明显减少;与对照组相比，心康组心肌细胞凋亡相对较少。见图1。

3.3  Caspase-3 mRNA、Caspase-9 mRNA比较

模型组与正常组比，Caspase-3、Caspase-9基因表达显著增加（P<0.01），表明凋亡基因增多;心康冲剂干预后，心康组Caspase-3、Caspase-9基因表达显著下降（P<0.01）;与对照组比，心康组Caspase-3、Caspase-9基因表达差异无统计学意义（P>0.05）。见表3。

3.4  Caspase-3、Caspase-9蛋白表达比较

与正常组比，模型组凋亡蛋白表达增多，Caspase-3、Caspase-9蛋白表达显著增加（P<0.01）;经心康冲剂、芪苈强心胶囊干预后，心康组及对照组Caspase-3、Caspase-9蛋白表达显著下降（P<0.01）;与对照组比，心康组caspase-3表达显著下降（P<0.05）。见表4、图2-3。

4 讨论

中医学将慢性心力衰竭类归于“水肿”“喘证”“心悸”等范畴。中医药治疗慢性心力衰竭疗效肯定，研究证明，芪苈强心胶囊有抗大鼠心肌细胞凋亡作用[10-11]。心康冲剂以真武汤、升陷汤及参苓白术散为基础方，具有健脾渗湿、温阳化气逐水饮功效，能有效治疗慢性心衰水肿、喘证、心悸等水湿内停之证[4]。

细胞凋亡发病机制主要有死亡受体通路、线粒体通路、内质网通路3条途径。其中由多种生物、理化刺激信号触发形成凋亡体，激活Caspase-9，从而剪切并激活下游的Caspase-3导致细胞凋亡，是内源性途径机制。Caspases介导心肌细胞凋亡并参与慢性心力衰竭的发生、发展[12-13]。Caspase-3是凋亡级联反应最关键的凋亡蛋白酶[14]。

本实验中，模型组心肌凋亡明显增多，LVIDd明显升高，而LVFS、LVEF显著下降，同时Caspase-3及Caspase-9的核酸及蛋白表达增加，表明凋亡组织中具有Caspase-3、Caspase-9表达增加的特征。心康冲剂干预后，心肌凋亡减轻，LVIDd明显下降，

LVEF、LVFS明显升高，表明心康冲剂具有缩小扩大的心脏、增强心肌收缩力、提升射血功能。与对照组比，心康冲剂组使心脏缩小、心功能提高更明显，并且下调Caspase-3蛋白表达更明显，而Caspase-3

mRNA表达无差异，表明心康冲剂调控Caspase-3的mRNA与蛋白表达呈非一致性，说明在调控Caspase-3的mRNA与蛋白表达中有其他因素参与;因此，临床实践及动物实验表明，心康冲剂具有良好的抗心衰竭及抗心肌凋亡作用，临床值得推广应用。

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