肖景惠逄 飞倪瑞琪迟乃玉王梦雨*

（1 大连大学生命科学与技术学院，辽宁大连 116622；2 辽宁省海洋微生物工程技术研究中心，辽宁大连116622）

灰葡萄孢菌（Botrytis cinerea Pers.）是一种世界范围的植物灰霉病病原菌，能够侵染植物的根茎、叶片、花和果实，导致500 多种植物病变，其中农作物超过200 种，包括番茄、草莓、葡萄等重要经济作物（陈凤平 等，2010；Elad et al.，2016）。灰葡萄孢菌是一种适宜在低温、高湿环境下生长的植物病原菌。在农业生产中，温室内温度通常保持在15～20 ℃，具有较高的相对湿度，极易引起灰霉病大范围的发生（严玉行和和中岳，2017）。在作物采摘后的贮藏和运输过程中，灰葡萄孢菌会加速其腐烂变质，导致严重的物流损失。目前，灰葡萄孢菌的防治手段以施加化学杀菌剂为主，虽可高效抑制病害，但也易产生抗药性，长此以往削弱了防治效果（Rupp et al.，2017），且化学防治手段不利于环境保护，残留药物会危害人畜健康（何美仙，2004）。

生物防治技术是通过调控生物体，利用生物物种间的相互抑制关系，使植物产生对病原体、害虫和杂草具有抵抗作用的代谢产物，进而达到增强植物抗性的保护手段。生物防治技术不会打破生态平衡且不会产生环境污染，属于重要的绿色防治手段，具有广阔的发展前途（王亚杰 等，2018）。本文通过对近年来国内外防治灰葡萄孢菌的生物、化学手段的作用机理进行综述，为今后灰葡萄孢菌的防治研究提供依据。

1 灰葡萄孢菌

灰葡萄孢菌可产生纤维素酶（cellulase）、果胶酶（pectinase）、几丁质酶（chitinase）、蛋白酶（protease）、脱落酸（abscisic acid）、毒素（toxin）等多种致病因子感染宿主（陶岚，2016）。在不适合繁殖的环境中，灰葡萄孢菌会以菌核、菌丝体或分生孢子的形式形成休眠体寄生于宿主中。在合适的条件下，萌生的菌丝会爆发，通过分生孢子借自然气候或人类生产活动进行传播（马晨 等，2018）。Benito 等（1998）在20 ℃使用人工喷雾的方式将灰葡萄孢菌接种于番茄叶片，并进行了详细观察，发现灰葡萄孢菌感染番茄叶片分为3 个阶段：导致宿主病残体坏死病斑形成（20 h）、休眠阶段（20～72 h）和最初坏死病斑的扩散（72 h 以上）。然而，灰葡萄孢菌在 4 ℃时感染番茄叶片的过程缓慢而稳定，番茄叶片无坏死现象（张智 等，2005）。

2 灰葡萄孢菌的化学防治

常用化学杀菌剂包括苯并咪哇类（benzodime）、N-苯基氨基甲酸酯类（benzodime）和苯胺基嘧啶类（anilinopyrimidine）等（王凌宇 等，2015）。由于灰葡萄孢菌具有快速繁殖、易基因突变、高适应性的特点，这些特点极大地增加了遗传变异的可能性。因此，灰葡萄孢菌易对常用的化学杀菌剂产生了不同程度的抗性。

2.1 苯并咪哇类杀菌剂

最具代表性的苯并咪哇类杀菌剂包括：甲基硫菌灵、苯菌灵、苯硫脲，化学式如图1-A 所示。它们的作用机制是抑制灰葡萄孢菌菌丝的伸长和孢子的分离，使微管蛋白和其他晶格结构的形成受阻，从而摧毁细胞的有丝分裂和必需蛋白的生成，进而表现出杀菌活性。

图1 常用化学杀菌剂的化学式

A，苯并咪哇化合物；B，N-苯基氨基甲酸酯化合物；C，苯胺基嘧啶化合物。

2.2 N-苯基氨基甲酸酯类杀菌剂

代表性的化合物为乙霉威，化学式如图1-B所示。作用机制是干扰灰葡萄孢菌菌核功能，并影响细胞膜和细胞壁肽聚糖结构，从而影响膜的通透性，导致细胞破裂，从而杀死致病菌株。

2.3 苯胺基嘧啶类杀菌剂

代表性化合物是嘧霉胺，化学式如图1-C 所示。其作用机制是抑制灰葡萄孢菌的胞外蛋白酶的分泌，减少病菌侵入位点寄主细胞的死亡。

2.4 稳定性二氧化氯（ClO2）

稳定性ClO2是世界上公认的最佳杀菌剂之一，具有高性能和优良控制效果。1996 年，我国质检相关部门将稳定性ClO2添加到食品添加剂行列，使稳定性ClO2在果蔬保鲜和海产品深加工中得以使用（GB 2760—1996）（郑庆伟，2018）。稳定性ClO2作为化学保鲜剂，在杀菌过程中不会发生氯的取代反应，不会产生致癌、致畸的有机氯代产物（集贤 等，2017），因此它可以作为绿色果蔬、海产品保鲜技术的潜在资源。稳定性ClO2也可作为采摘后果蔬抗灰葡萄孢菌的有效化合物（傅茂润，2005）。它的作用机制是能够有效地抑制采摘后果蔬灰葡萄孢菌过氧化物酶（peroxidase，POD）、多酚氧化酶（polyphenol oxidase，PPO）和L-苯丙氨酸解氨酶（L-phenylalanin ammo-nialyase，PAL）等防御酶活性的提高，使其对灰霉病的抗性增强，达到抑制病菌活性的效果。因此，无论对于离体还是活体有伤接种的采后果蔬，适宜浓度的稳定性ClO2均具有较好的灰葡萄孢菌抑菌活性和防病效果。

2.5 新型化学试剂

由于灰葡萄孢菌对常用化学杀菌剂易产生抗性，为解决这一问题，多种新型的化学试剂如吡咯（pyrrole）、啶酰菌胺（boscalid）、嘧菌环胺（azoxystrobin）、氟噻唑吡乙酮（f luthiazolone）、环酰菌胺（fenhexamid）等被发掘利用。

吡咯杀菌剂中的咯菌腈（f lammonitrile）的主要杀菌机制是作用于渗透调节的信号传递途径，因此防御效果较好。研究显示，咯菌腈对灰葡萄孢菌的杀菌机制和抑菌机制有很大区别，杀菌机制主要是干扰并破坏其中心代谢通路的氧化途径和菌体所需主要蛋白质的生物合成过程，溶解病原菌的细胞壁，破坏细胞膜上的疏水键，破坏核酸与蛋白质的合成，并氧化生命活动的主要蛋白质（杨玉柱和焦必宁，2007）；而抑菌机制则是通过减弱与葡萄糖磷酸酰化有关蛋白质的传递来抑制病原菌菌丝的生长，最终导致病原菌的终结（张亚 等，2018）。

啶酰菌胺是一种通过抑制线粒体呼吸电子传递链上的传递载体-琥珀酸Q 还原酶活性来抑制线粒体呼吸的化合物，达到阻止病原菌菌丝生长的作用，其作用机理与其他酰胺类和苯甲酰胺类化合物类似。嘧菌环胺防治灰葡萄孢菌的作用机理是抑制真菌酯酶（esterase）、肽酶（peptidase）、核酸酶（nuclease）等水解酶的分泌和必需氨基酸甲硫氨酸的生物合成（王智 等，2016）。国外生产上经常将啶酰菌胺与嘧菌环胺二者联合使用。

氟噻唑吡乙酮是一种对卵菌纲病害表现出卓越防效的化学杀菌剂，通过对氧化固醇结合蛋白（oxysterol binding protein，OSBP）的抑制，阻止其穿梭细胞膜，从而达到杀菌效果。氟噻唑吡乙酮对灰葡萄孢菌具有预防、治疗和抑制产孢作用，且药效稳定、耐雨水冲刷、可快速被植物蜡质层吸收。施药时用量少，叶面喷雾和种子处理均可。对用户、农业生产者和环境的安全性高（刘瑞宾 等，2018）；具有广谱性和内吸性，可以更好地控制灰葡萄孢菌（杨子辉 等，2017），其防效优于目前生产上推广使用的多种常规杀菌剂。德国拜耳公司开发出了一种新型的酰胺类杀菌剂—环酰菌胺，具有内吸性和保护性。研究表明，环酰菌胺具有独特的抗灰葡萄孢菌的作用机制，并且它与现有化学杀菌剂苯并咪唑、N-苯基氨基甲酸酯、苯胺嘧啶等无交叉抗性（辉胜，2018），结合热力烟雾器防治，可以增加环酰菌胺在植物叶片上的沉积量，提高对温室植物灰葡萄孢菌的防治效果（王学贵 等，2016）。

3 灰葡萄孢菌的生物防治

3.1 拮抗菌防治手段及作用机理

3.1.1 真菌防治 真菌是灰葡萄孢菌拮抗菌的主要菌群。1957 年，Newhook 在番茄植株上均匀喷洒芽枝霉（Cladosporium）孢子发酵液，以减少番茄果实中灰霉病的发生，是世界上早期使用真菌来防治灰葡萄孢菌的例子（Tronsmo & Dennis，1977）。据统计，有20 多种拮抗真菌可以用来防治灰霉病，其中木霉属和酵母菌属为主要研究对象。木霉属中对灰葡萄孢菌具有拮抗作用的菌株主要包括哈茨木霉（Trichoderma harzianum）、钩状木霉（T.hamatum）、拟康氏木霉（T. pseudoningii）以及绿色木霉（T. viride）等。木霉对灰葡萄孢菌的防控机制是利用细胞壁降解酶，如胞外纤维素酶、果胶酶、几丁质酶使灰葡萄孢菌细胞壁的主要成分纤维素、果胶、几丁质等物质分解，引起灰葡萄孢菌细胞壁的降解和菌丝崩解，进而使细胞内生理代谢遭到破坏（徐文 等，2017）。1977 年，Tronsmo 和Dennis首次发现哈茨木霉（T. harzianum）对草莓灰葡萄孢菌具有良好的防治效果（Tronsmo & Dennis，1977）。 研 究 发 现， 每667 m2施 用100～150 g 3×108CFU · g-1哈茨木霉菌（T. harzianum）可湿性粉剂，对草莓灰葡萄孢菌的防治效果可达75%左右（张富荣 等，2018）。

拮抗酵母菌主要用于植物采摘后灰葡萄孢菌的生物防治。作用机理为：与病原菌竞争营养物质或生存空间，或对病原菌产生直接寄生作用，也可以诱导宿主自身抗病性。Redmond 等（1987）用黑色酵母菌（Exophiala jeanselmei）和浅白隐球酵母菌（Cryptococcus albidus）防治灰葡萄孢菌，其中黑色酵母菌对灰葡萄孢菌的防治效果达到63%，与杀菌剂扑海因（74%）的防治效果虽然有一定差距，但也足可见其具有良好的防治前景。王傲雪等（2018）研究了生防酵母菌对番茄离体果实灰葡萄孢菌的防治效果，结果表明，3 株生防酵母菌均可抑制番茄灰葡萄孢菌的繁殖，其中生防酵母菌（C.albidus 64）防治效果最佳，单一菌液处理的防治效果高达95.83%；当番茄离体果实同时接种生防酵母菌和灰葡萄孢菌，防治效果达69.57%。

3.1.2 细菌防治 目前，有10 多种细菌应用于灰葡萄孢菌的防治和研究。主要包括芽孢杆菌（Bacillus spp.）、假 单 胞菌（Pseudomonas spp.）、欧文氏菌（Erwinia spp.）和格式沙雷菌（Serratia spp.）等。其生防作用机理与真菌相似，通过抑制灰葡萄孢菌果胶酶活性，并诱导植物细胞产生抗生素以及对灰葡萄孢菌产生营养竞争从而抑制其生长。冯玉龙等（1999）在草莓根部土壤里分离出22 株芽孢杆菌，对草莓灰葡萄孢菌有着不同程度的拮抗作用，这也表明灰葡萄孢菌具有丰富的拮抗菌资源。童蕴慧等（2001）分离获得对番茄灰葡萄孢菌有抑制作用的拮抗菌58 株，大部分拮抗细菌为芽孢杆菌，在温室中的防效达76.6%～85.3%。李华（2005）筛选出的低温海洋芽孢杆菌，对灰葡萄孢菌的最低抑菌浓度为4 μL · mL-1，在该浓度下对灰葡萄孢菌的生物防治效果为85.1%。陆继臣等（2013）从蔬菜根际土壤中筛选出格氏沙雷菌（Serratia spp.），能显著抑制灰葡萄孢菌分生孢子的萌发，抑制率达99%。王晓辉等（2015）从大连大黑山林间土壤中筛选出解淀粉芽孢杆菌 K1（Bacillus amyloliquefaciens K1），对灰葡萄孢菌有稳定的抑制作用，抑菌圈直径达到45 mm。然而，解淀粉芽孢杆菌K1 的抑菌机制较复杂，需要进一步研究。罗琳等（2017）从红枣中分离得到的内生细菌T2，在植物叶片离体和活体试验中均对灰葡萄孢菌具有良好的防治效果，并具有广谱抗性，经16S rDNA 鉴定为解淀粉芽孢杆菌（Bacillus amyloliquefaciens）。马超等（2018）以从植物中分离的内生细菌为材料，筛选出对番茄灰葡萄孢菌等有拮抗作用的菌株解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌，发酵液对番茄灰葡萄孢菌的抑制率分别达到86.6%和83.0%，且2 个菌株对黄瓜灰霉病菌等9种病原菌也有较高的拮抗活性。

3.2 天然产物防治

早在2004 年，何培青便发现植物挥发性物质如脂肪酸衍生物、单萜和倍半萜化合物以及芳香族化合物具有抑制植物灰霉病的作用，番茄叶片释放的挥发性物质对灰葡萄孢菌孢子的萌发抑制率为34.5%，对菌丝生长的抑制率为75.2%，抑制灰葡萄孢菌的效率依次为脂肪酸衍生物＞芳香族化合物＞萜类化合物（何培青，2005）。刘树芳等（2006）利用268 种放线菌次生代谢产物作为筛选对象，发现其中16 种对百合灰葡萄孢菌孢子萌发的抑制率可达80%，10 种对黄瓜离体叶片的灰葡萄孢菌防治效果可达到50%。王帅宇等（2008）研究发现，用20% β-羽扇豆球蛋白多肽可溶液剂 0.93 g · L-1和0.67 g · L-1两种浓度喷雾植物叶片后，田间对灰霉病的防治效果分别为82.71%、56.20%，显著高于对照50%腐霉利可湿性粉剂，且持效性存在显著优势，但速效性则处于劣势。李瑞环等（2012）研究证实，4.5%丙 · 壳寡糖可溶性药剂（丙烷脒4%+壳寡糖0.5%）对灰葡萄孢菌具有抑制效果，常规喷雾方法可用于控制植物果蔬的灰霉病。邹陈文翔（2016）对链霉菌SN-194 的次级代谢产物—二荫类化合物进行提取纯化，对灰葡萄孢菌的抑制率为24.73%～80.08%。王晓莹（2016）发现壳聚糖寡糖抑制了草莓灰葡萄孢菌菌丝的生长及其孢子萌发，用壳聚糖寡糖溶液处理新鲜草莓果实，随着溶液质量分数的增加，对灰葡萄孢菌的抑制作用增强。俞晗（2017）研究发现致病杆菌（Xenorhabdus bovienii）SN 84 菌株发酵液产物浓度为2%时，对番茄灰葡萄孢菌菌丝生长的抑制率近50%，当浓度为8%时，抑制效果最佳。

4 化学防治与生物防治的比较

4.1 化学防治的优缺点

目前，农业领域灰葡萄孢菌的主要防治措施仍然是施用化学杀菌剂。防治成本低、防治效果快、效率高，能迅速有效地控制病虫害的蔓延。这是生物防治方法难以达到的。其使用方法简便，既可以利用药械施药，也可以用各种人工土法土械来施药。化学杀菌剂品种繁多，不同品种的农药可以混合使用，以达到兼治的目的，能够减轻劳动强度，节省成本。但化学杀菌剂施用不当会造成安全隐患和经济损失，严重时会破坏原生物群落结构，打破农业生态的自然稳态平衡。

此外，长期使用化学杀菌剂会使病原菌产生抗药性。卢晓雪等（2018）对长三角地区果蔬灰葡萄孢菌抗药性进行检测，结果显示：灰葡萄孢菌菌株对嘧霉胺、多菌灵、腐霉利、咯菌腈、啶酰菌胺的抗性频率分别达 68.57%、70.48%、68.10%、0.15%、23.00%。肖婷等（2018）采用区分计量法对江苏省句容市灰葡萄孢菌对啶酰菌胺的抗药性进行研究，结果表明总抗性菌株占42.60%。杜颖（2018）从辽宁省8 个地区的番茄种植区中采集、分离纯化得到番茄灰葡萄孢菌115 株，采用菌丝生长速率法测定其对腐霉利的抗药性，结果表明抗性频率达到83.48%。可见，灰葡萄孢菌极易产生抗药性，因此灰葡萄孢菌化学防治的发展历史一直以来是为解决病原菌抗药性而不断推陈出新的过程。

4.2 生物防治的优缺点

生物防治是近年来新兴起的热门治理手段，虽然拮抗菌的报道很多，但真正应用于农业生产的却很少。最大的阻力是因为拮抗微生物在防治灰葡萄孢菌方面的作用受到多种因素的影响，其中最重要的是菌体所处的生态环境（吕婷，2018）。环境因素既可以影响拮抗菌活性的表现，又可以影响植物体表面拮抗菌的固定繁殖。相比较化学杀菌剂，拮抗微生物在使用时操作方法繁琐，并且必须明确拮抗微生物使用的适宜浓度、时间和方法，使之统一并规范化，才可以保证田间防治效果的稳定。而且与化学杀菌剂的广泛性不同，拮抗菌具有专一性，一种拮抗菌只能对一种或一类病害微生物有拮抗效果（王晓辉 等，2015）。但生物防治的突出优势是它更符合绿色、循环利用和可持续的农业发展趋势，因为生物防治对人畜安全无毒，无污染、不残留、无添加。其次，拮抗微生物对病原菌具有很强的特异性，对天敌和有益生物负作用小，不会打破生态稳态平衡。

5 展望

灰葡萄孢菌是一种世界范围的植物病原菌。化学防治是目前控制其蔓延的主要手段之一，但随着灰葡萄孢菌抗药性的不断增强，研究人员希望通过对灰葡萄孢菌抗性机制的研究，开发出新型复合杀菌剂来延缓菌株抗药性的产生，延长药剂使用寿命；合理评定使用时间和使用剂量以减少对生态平衡的破坏。Elad（1994）利用分离出的腐生性酵母菌红酵母菌（Rhodotorula glutinis）和浅白隐球酵母菌（Cryptococcus al-bidus），对菜豆和番茄的灰葡萄孢菌进行防治效果研究，显示其在温室内具有较好的防治效果，已经和哈茨木霉相当。商业杀菌剂Trichodex 已经在包括欧洲和北美在内的20 多个国家注册，推广和应用。以色列 Makhteshim-Agan公司研发的以哈氏木霉作为拮抗菌的商品化防腐剂已面世，可防治由灰葡萄孢菌引起的果蔬灰霉病。可以预见，生物防治类灰葡萄孢菌防控制剂在国外的商业开发将会越来越多。随着产品防效的不断提高，将会具有巨大市场潜力，并取得较好的经济效益。