周浩，涂芬，付欣，钟清，祝欣然，苏云霞，杨芳*

(1.武汉工程大学 环境生态与生物工程学院，武汉 430205；2.武汉工程大学 化工与制药学院，武汉 430205)

板栗(CastaneamollissimaBlume)属壳斗科栗属坚果类植物[1]，在世界范围内被作为重要的农作物之一。板栗深加工过程中产生大量的板栗壳仍以燃烧和自然腐烂等方式处理[2]，这样既造成了资源浪费也不利于环保。据资料显示，板栗壳中含有色素、有机酸、多酚类、多糖(或苷类)和鞣质等化学成分[3]。板栗壳的多酚类物质主要组分为单宁，而单宁的种类包括很多，其中具有抗氧化活性结构的主要成分为鞣花单宁和原花青素。人体内的自由基过剩会引起多种疾病[4]，包括心血管疾病、白内障、阿尔茨海默氏症等，但是体内的内源性抗氧化物质不足以防御细胞损伤，所以从食物资源中寻找天然抗氧化剂已成为研究热点。有研究表明板栗壳原花青素具有抵御自由基、抑菌杀菌等作用，可以广泛应用于食品及调味品行业[5]。丁培峰研究了茶多酚在酱油中的防腐效果，结果显示，茶多酚与纳他霉素复配使用后与山梨酸钾具有等同的防腐效果，且安全性大大提升[6]。同时，茶多酚具有一定的保健功效，可提高酱油的营养价值和保健功能。

多酚类物质虽然具有多种生理活性和延长调味品保质期的效果，但是外界条件也会影响其稳定性，从而降低它的生理活性，且人体中的胃液及肠道消化液也会对多酚的活性产生影响[7]。例如，提取自姜黄根茎的多酚类化合物姜黄素的药理作用广泛，毒性小，并且长期以来作为调味品和食品添加剂在国内外广泛应用，但是，由于其生物利用度低显著影响其应用价值[8]。目前对板栗壳原花青素的研究主要在抗氧化性及提取优化等方面，对其作为调味品功能性添加剂的开发以及其在人体中的消化吸收研究较少。因此，本实验探究影响板栗壳粗提物中原花青素稳定性的因素，利用HPLC-MS研究其种类并进行结构表征，同时通过人体体外消化模型研究其消化情况，为板栗壳中天然抗氧化剂的开发及其在食品和调味品方面的应用提供一定的参考依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

板栗：取自山东祁蒙山。

香草醛、α-淀粉酶、胆汁提取物、胰蛋白酶、胃蛋白酶：国药集团化学试剂有限公司；标准品表儿茶素、没食子酸、表儿茶素没食子酸酯、没食子儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯以及表没食子儿茶素没食子酸酯：上海阿拉丁生化科技股份有限公司。

1.2 仪器与设备

TG16-WS离心机 长沙湘智离心机仪器有限公司；UV-1800紫外可见光分光光度计 上海美诺达仪器有限公司；pH计 梅特勒-托利多仪器(上海)有限公司；Agilent 1100 LC-MSD/TOF高分辨液相质谱联用仪 美国安捷伦科技公司。

1.3 试验方法

1.3.1 板栗壳粗提物提取制备

将板栗壳洗净晾干，粉碎过40目筛得到板栗壳粉末。参考苏云霞等研究得到的最佳提取工艺，取适量板栗壳粉末加入70%乙醇水溶液，使料液比为1∶15(g/mL)，在65 ℃的条件下提取90 min，再将提取液进行真空抽滤，滤液在40 ℃下真空浓缩，再次冷冻干燥，低温保存备用[9]。

1.3.2 板栗壳粗提物中原花青素稳定性影响因素研究

1.3.2.1 板栗壳原花青素溶液的制备

称取板栗壳粗提物0.1 g，用蒸馏水定容至100 mL，研究光照、温度、金属离子和pH对原花青素的影响。

1.3.2.2 光照对板栗壳原花青素的影响

取10 mL板栗壳原花青素溶液3份，分别置于室温光照、室温避光和低温避光的条件下，放置4 d，每隔1 d取样测定样品溶液中原花青素含量(以保存率表示)；原花青素保存率=样品待测时原花青素含量/样品初始原花青素含量×100%。原花青素的测定方法采用硫酸-香草醛比色法[10,11]。

1.3.2.3 温度对板栗壳原花青素的影响

取10 mL板栗壳原花青素溶液6份，分别在40,50,60,70,80,90 ℃条件下恒温水浴2 h，原花青素含量测定方法同上。

1.3.2.4 pH对板栗壳原花青素的影响

取10 mL板栗壳原花青素溶液14份，用HCl和NaOH溶液配制成pH为1～14的溶液，将原花青素样品与10 mL pH为1～14的溶液混合，密封静置6 h，原花青素含量测定方法同上。

1.3.2.5 金属离子对板栗壳原花青素的影响

配制0.02 mol/L含Fe3+、Fe2+、Ba2+等金属离子的溶液待用，再把不同金属离子溶液与原花青素溶液等体积混合，密封放置一段时间，观察溶液颜色变化。

1.3.3 板栗壳原花青素结构分析

用高效液相测定没食子酸、没食子儿茶素、表儿茶素、没食子儿茶素没食子酸酯、表没食子儿茶素没食子酸酯、表儿茶素没食子酸酯6种标准品及板栗壳粗提物出峰时间，比较得出板栗壳粗提物中所含物质，并对粗提物进行高分辨质谱结构分析。

色谱条件[12-14]：色谱柱为DIONEX C18(4.6 mm×250 mm，5 μm)，流动相：甲醇(B)(体积分数为0.05%)-三氟乙酸(A)，梯度洗脱：0～12 min,A：87%～75%，B：13%～20%；12～23 min，A：75%～20%，B：25%～80%；23～26 min，A：87%，B：13%。流速：0.5 mL/min；检测波长：280 nm；柱温：35 ℃；进样量：20 μL。

质谱分析条件[15]：色谱柱为Lichrosphers C18柱(4.6 mm×250 mm，5 μm)；质谱进样分流比为1∶1；负离子模式；离子化方式： ESI-；扫描范围： m/z 50～2000；干燥气温度：350 ℃；干燥气流速：15 L/min；喷雾压力：40 psi；毛细管电压：3500 V。

1.3.4 板栗壳原花青素的消化吸收[16]

1.3.4.1 消化体系的制备

胃液环境配制[17-19]：在250 mL烧杯中加入0.4 g的胃蛋白酶、9 mg/mL的氯化钠溶液90 mL混匀，再转入100 mL的容量瓶中，用1 mol/L盐酸调节使溶液pH为2～2.3，直至溶液至容量瓶刻度线。

肠道环境配制：在250 mL烧杯中加入225 mg的胰蛋白酶、225 mg的胆汁提取物、9 mg/mL的氯化钠溶液90 mL混匀，再转入100 mL的容量瓶中，用1 mol/L氢氧化钠调节使溶液pH为7～7.2，直至溶液至容量瓶刻度线。

1.3.4.2 模拟胃液消化

设置5组平行试验和1个空白对照，每组平行实验条件如下：在50 mL锥形瓶中依次加入中口腔消化液4 mL、胃消化液16 mL，于37 ℃、转速为250 r/min的摇床中震荡反应2 h，每0.5 h测1次pH值，通过测pH的变化可初步判断原花青素是否消化；并在反应时间为0.5，1，1.5，2 h各取1 mL消化液，测定原花青素的含量，并计算其消化率；消化率=(1-测得原花青素质量/最开始加入原花青素质量)×100%。

1.3.4.3 模拟肠道消化

设置5组平行试验和1个空白对照，每组平行实验条件如下：量取胃液消化液20 mL，用氢氧化钠中和到pH为7，终止胃液消化反应；再加入20 mL肠道消化液反应2 h，并在反应时间0.5，1，1.5，2 h各取1 mL消化液测定原花青素的含量，并计算其消化率。

2 结果与分析

2.1 板栗壳原花青素稳定性影响因素研究

2.1.1 光照对板栗壳原花青素稳定性的影响

图1 光照对原花青素稳定性的影响Fig.1 Effect of light on the stability of proanthocyanidins

由图1可知，板栗壳原花青素溶液在光照条件下，原花青素的保存率对比另外两种情况下降速度更快，同时光照条件下溶液颜色易由棕红色变成淡红色，而在室温避光和低温避光条件下，颜色没有明显变化；这与高凝轩等的实验结果一致，可能原花青素的结构在光照条件下被破坏，故光照对原花青素的稳定性有影响[20]。

2.1.2 温度对板栗壳原花青素稳定性的影响

图2 温度对板栗壳原花青素稳定性的影响Fig.2 Effect of temperature on the stability of proanthocyanidins

由图2可知，温度在40～60 ℃范围内，原花青素的保存率基本不变，即在该温度范围内，原花青素相对比较稳定，降解不大；当温度高于60 ℃时，板栗壳原花青素保存率不断下降，高温可能导致原花青素发生氧化聚合，则板栗壳原花青素在提取、浓缩、干燥及保存过程中，应使温度低于60 ℃。

2.1.3 pH对板栗壳原花青素稳定性的影响

图3 pH对板栗壳原花青素稳定性的影响Fig.3 Effect of pH on the stability of proanthocyanidins

由图3可知，当pH在1～7范围内，原花青素保存率变化很小，则此pH值范围适于原花青素的保存；当pH>7时，随着pH增大，原花青素保存率不断下降，且当pH>8时，原花青素溶液颜色发生变化；根据报道，原花青素在碱性条件下其结构易发生降解和差向异构化[21]，导致含量下降。即碱性条件下容易造成板栗壳原花青素结构的破坏，使稳定性下降。

2.1.4 金属离子对板栗壳中原花青素稳定性的影响

原花青素对金属离子较敏感，多价金属离子可以与原花青素的邻二酚羟基发生络合反应，形成五元环螯合物。板栗壳原花青素在K+、Na+、Al3+、Mg2+条件下没有发生变化；在Cr3+、Zn2+、Sn2+、Ca2+条件下产生少量絮状物，而在Fe3+、Fe2+、Ba2+存在的条件下产生大量黑色絮状物，这是由于Fe3+、Fe2+、Ba2+与原花青素的邻位二羟基形成了不溶性的络合物。故在原花青素样品保存过程中，应注意避免与Fe3+、Fe2+、Ba2+接触。

2.2 原花青素结构分析

2.2.1 原花青素种类鉴定

板栗壳粗提物组分复杂，对比文献[22-24]报道的原花青素类质荷比，选择合适的分子离子峰进行碰撞诱导解离，根据二级质谱裂解获得的碎片离子及文献进一步对比，鉴定出粗提物中原花青素种类有没食子酸、儿茶素、没食子儿茶素、B型原花青素二聚体，HPLC-MS分析结果见表1。

表1 板栗壳粗提物原花青素HPLC-MS分析结果Table 1 Analysis results of proanthocyanidins from crude extracts of chestnut shell by HPLC-MS

2.2.2 没食子酸二级质谱裂解规律分析

没食子酸的苯环上含有3个羟基和1个羧基，在ESI-的质谱条件下失去1个H离子生成[M-H]-，以m/z 169.2为母离子进行碰撞诱导解离，其主要的裂解碎片离子为m/z 124.7，与文献[25]的报道一致。分子离子裂解规律见表2，m/z 124.7为失去一分子羧基所得。

2.2.3 儿茶素二级质谱裂解规律分析

儿茶素主要的二级碎片离子有m/z 124.7，178.7，204.7，244.7，与刘国强等报道的结果吻合[26]。分子离子峰裂解规律见表2，碎片峰1的m/z 24.7为A环的1，4开环裂解得到；m/z 178.7为[M-H]-失去一分子C6H6O2产生的碎片离子峰；m/z 204.7为[M-H]-失去两分子C2H2O产生； m/z 244.7为[M-H]-失去一分子CO2所得。

2.2.4 没食子儿茶素二级质谱裂解规律分析

经HPLC-MS分析后得到的主要二级碎片离子有m/z 286.8，124.9，根据许文等研究报道确认为没食子儿茶素，分子离子峰裂解规律见表2，m/z 286.8为[M-H]-失去一分子水所产生的碎片离子峰；m/z 124.9为A环的1，4开环裂解得到[27]。

2.2.5 B型原花青素二聚体二级质谱裂解规律分析

B型原花青素二聚体是原花青素单体通过C4-C8或C4-C6相连并在C2和C7或者C2和C5之间形成C-O-C键的化合物[28]，在ESI-模式下失去1个H得到m/z 576.8，以m/z 576.8为母离子进行碰撞诱导解离，其主要的裂解碎片离子为m/z 288.7，406.8，424.7，450.9，558.9，与杨代晓等报道的结果一致，故可鉴定为B型原花青素二聚体[29]。分子离子峰裂解规律见表2，m/z 288.7是分子间断裂失去1个A-unit聚合单元得到；m/z 406.8是分子离子先发生RDA反应，再失去一分子水得到；m/z 424.7是由分子离子发生RDA反应所得；m/z 450.9是由分子离子失去间苯二酚得到；m/z 558.9是分子离子失去一分子水所得。

表2 板栗壳粗提物二级质谱中主要碎片离子及裂解规律Table 2 The main fragment ions and cracking rule in secondary mass spectra of crude extracts from chestnut shell

2.3 板栗壳粗提物中原花青素的消化吸收结果分析

2.3.1 原花青素在模拟胃液中的消化结果

板栗壳粗提物在模拟胃液中的消化情况见图4，原花青素在胃液条件下被分解，消化时间越长，原花青素的含量越低。

图4 原花青素胃消化结果Fig.4 Gastric digestion results of proanthocyanidins

由图4可知，原花青素的最大胃消化率为18.7%。

2.3.2 原花青素在模拟小肠液中的消化结果

板栗壳粗提物在模拟小肠液中的消化情况见图5，原花青素的消化率随时间增加逐渐增大，在1.5～2 h时间内，原花青素的消化速率几乎不变，表明原花青素在模拟小肠中的消化已完全。

图5 原花青素肠消化结果Fig.5 Intestinal digestion results of proanthocyanidins

由图5可知,原花青素的最大肠消化率为20.5%。蔬菜和水果中的多酚主要以可溶性形式存在，而禾谷物中的酚类主要以结合态形式存在，结合态酚类主要与细胞壁成分共价结合，但由于细胞壁纤维物质难以消化，所以结合态酚类在胃及小肠中难以被消化。通常用酸水解糖苷键或碱水解醚键、酯键来提取结合态酚类，而乙醇则用来提取可溶性酚类。本实验中用乙醇来提取板栗壳原花青素，故粗提物中多酚主要以可溶性酚类为主。李俶等研究了几种多酚化合物体外模拟消化，结果表明儿茶素、表儿茶素在模拟胃液消化过程中稳定性较差，含量分别下降16.6%、6%，而在模拟肠道消化过程中，仅表儿茶素和没食子酸的含量下降。Tenore等发现儿茶素在胃肠消化液中含量下降是由于儿茶素对胃肠道的酸碱pH值敏感，肠道碱性环境和溶解氧引起儿茶素二聚体自氧化[30]。故导致板栗壳原花青素在模拟胃液消化中含量下降的原因可能是儿茶素和表儿茶素被降解，在模拟肠道消化中含量下降的原因可能是表儿茶素、儿茶素、没食子酸被降解。

3 结论

综上所述，光照、温度、pH及金属离子均会影响板栗壳原花青素的稳定性。当温度大于60 ℃、pH>7以及金属离子Fe3+、Fe2+、Ba2+存在的条件下均会破坏板栗壳原花青素的结构。通过体外消化模拟实验，发现原花青素在小肠及胃中的消化率达到18.7%和20.5%。利用HPLC-MS对板栗壳粗提物进行结构分析，根据分子量及二级质谱碎片离子鉴定出粗提物中含有没食子酸、儿茶素、没食子儿茶素和B型原花青素二聚体。本课题组前期研究显示，板栗壳提取物具有显著的体外抗氧化活性，在本研究基础上，综合考虑其在体外的稳定性和体内消化特性，为将其开发成既具有抗氧化活性又具有生理功能的调味品添加剂提供了科学根据。