郑莎莎，胡萍

(贵州大学 酿酒与食品工程学院，贵阳 550025)

凯里红酸汤是用西红柿、新鲜红辣椒、食盐等经自然发酵而成的一种调味品，用其煮制的火锅口感醇厚、细腻、柔和、酸味纯正、辣味悠厚、咸味适中，并且具有开胃、健脾、增强食欲的独特作用，其味道鲜美，百食不厌，深受海内外消费者的青睐[1]。

番茄作为主要原料，因其对人体健康的有益作用被认为是一种重要的功能性食品[2]，而番茄的益生功效与其所含的抗氧化物质、有机酸等密切相关[3]，如番茄红素、β-胡萝卜素、维生素E、维生素C、酚类物质、乳酸等[4]；其中，番茄红素、酚类和类黄酮作为天然的抗氧化物质，对人体的健康有着重要的意义。有研究报道通过乳酸菌发酵红酸汤，可以使红酸汤中的番茄红素、酚类物质等含量上升[5-8]，并且通过乳酸菌中糖苷酶的作用转化为抗氧化活性更高以及更易于人体吸收的物质，使得其营养价值得到极大的提升。

红酸汤产业在迅速发展的同时，也存在着一些制约企业规模化生产的问题：企业一直采用传统的自然发酵工艺，发酵液中微生物来源复杂，红酸汤中微生物的生长无法合理控制，且发酵出来的红酸汤品质不均，发酵周期长，影响番茄红酸汤发酵的品质，这样不利于红酸汤产业的规模化生产。故本研究采用从自然发酵红酸汤中分离出来的两株优势乳杆菌进行复合发酵，以未接菌组作为对照，测定红酸汤发酵过程中相应的理化指标并进行分析，对接菌发酵的方式进行评价，为今后红酸汤乳酸菌发酵剂的制备提供数据支撑。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

番茄、糯米粉、食盐、生姜、辣椒、白酒：均购于当地超市。

主要试剂：氢氧化钠、酚酞、3，5-二硝基水杨酸、四硼酸钠、亚铁氰化钾、对氨基苯磺酸、盐酸萘乙二胺、盐酸、磷酸二氢铵、无水乙醇、甲醛(浓度为38%)、葡萄糖标品、氯化钠、MRS肉汤培养基、MRS琼脂培养基、甲醇(色谱纯)、乳酸、草酸、苹果酸、酒石酸、琥珀酸等：北京索莱宝科技有限公司。

1.2 仪器与设备

HPX-9082 MBE型数显电热培养箱 上海博迅实业有限公司医疗设备厂；便携式pH计 深圳德图仪表有限公司；FA2004N电子天平 上海菁海仪器有限公司；TGL20M台式高速冷冻离心机 长沙迈佳森仪器设备有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台 苏州苏洁净化设备有限公司；LS-B75L-I型立式压力蒸汽灭菌锅 江阴滨江医疗设备有限公司；Agilent 1260型高效液相色谱仪(配有可变波长紫外检测器) 美国安捷伦公司；SinoChrom ODS-BP C18色谱柱(4.6 mm×200 mm，5 μm) 大连伊力特分析仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 发酵剂的制备

干酪乳杆菌H1与鼠李糖乳杆菌H3经MRS肉汤培养基活化后，离心得到菌体，用浓度为0.85%的生理盐水调整浓度为109CFU/mL备用。

1.3.2 红酸汤的制作工艺

番茄→挑选→去杂、去柄→洗净→晾干→切碎→加入糯米、辣椒、姜→粉碎→巴氏杀菌(低温消毒65 ℃)→混匀→加入盐、白酒→发酵→成品。

1.3.3 理化指标的测定

pH的测定：采用PHS-3C pH计测定；总酸的测定：参照GB/T 12456-2008《食品中总酸的测定》[9]；氨基酸态氮(AN)的测定：参照GB 5009.235-2016《食品中氨基酸态氮的测定》[10]；还原糖含量的测定：参照NY/T 2742-2015《水果及制品可溶性糖的测定》[11]；亚硝酸盐含量的测定：参照GB 5009.33-2016《食品中亚硝酸盐的含量测定》[12]；挥发性风味物质的测定：样品送至贵州省中国科学院天然产物化学重点实验室进行分析测定[13]；有机酸的测定：参照熊瑛等人[14]的方法；乳酸菌计数：参考江志杰等人的研究方法进行乳酸菌计数[15]。

1.3.4 数据处理与统计分析

所有试验均重复3次，结果用平均值±标准差来表示，使用Oringe 2018 Pro作图，分析数据的变化趋势，用统计分析软件SPSS 20.0对数据进行分析处理。

2 结果与分析

2.1 红酸汤发酵过程中乳酸菌的动态变化

图1 红酸汤发酵过程中乳酸菌计数Fig.1 Lactic acid bacteria count in the fermentation process of red sour soup

乳酸菌是红酸汤发酵过程中的主要菌群，通过乳酸菌的发酵产生有机酸、氨基酸等代谢产物，这些代谢产物本身以及通过相互作用赋予了红酸汤独特的风味。红酸汤开始发酵后，酸汤中营养物质由于渗透压的作用析出，使得乳酸菌的生长环境优越，且红酸汤中加入了生姜、盐等物质，能够在发酵前期有效地抑制腐败菌的生长；开始发酵后，发酵液中营养物质迅速被利用以促进其生长。由图1可知，接菌组初始的乳酸菌计数为107CFU/mL，在发酵的前3 d，乳酸菌数量呈快速上升的趋势，到第3天时达到109CFU/mL；随着红酸汤中的营养物质被消耗殆尽以及代谢产物的影响，乳酸菌数量也开始下降[16]；而未接菌组在发酵开始时，红酸汤中的乳酸菌数量较少，为102CFU/mL，主要是因为未接菌中杂菌较多，抑制了乳酸菌的生长，因此发酵前期以异型发酵和酒精发酵为主[17]，发酵后期则以正型发酵为主，此时乳酸菌数量急剧升高，第9天乳酸菌活菌数达到最高，为107CFU/mL，之后便开始下降。

2.2 红酸汤发酵过程中pH的动态变化

图2 红酸汤发酵过程中pH值的变化Fig.2 Changes of pH in the fermentation process of red sour soup

由图2可知，两组红酸汤的pH值随发酵时间的延长呈下降的趋势，发酵第3天时，未接菌组的pH值从初始的3.96±0.005下降至3.8±0.005，而接菌组的pH值则从初始的3.96±0.005快速下降至3.31±0.001，达到未接菌组第13天的pH值，下降速度显著大于未接菌组，这主要是由于乳酸菌接种到红酸汤中成为优势菌群，快速利用发酵液中的碳水化合物产生乳酸等酸类物质，从而快速降低了酸汤的pH值[18]，随着发酵的进行，其他代谢产物的积累以及氨、胺类等碱性含氮物质的产生，使pH值变化速度减缓。pH值不仅影响微生物的生长，还对食品中内源酶的活性具有重要意义，是衡量食品风味和口感的重要指标[19]。

2.3 红酸汤发酵过程中总酸含量的动态变化

由图3可知，总酸含量在两组红酸汤发酵过程中随时间的变化不断地增加，总酸含量的增加是由于酸汤发酵过程产生大量的有机酸。在发酵第5天时，未接菌组的总酸含量从初始的(0.442±0.000)%上升至(0.6±0.022)%，而接菌组的总酸含量则从初始的(0.442±0.000)%快速上升至(1.0±0.022)%左右，达到未接菌组第15天的总酸含量，达到快速产酸的目的。

图3 红酸汤发酵过程中总酸的变化Fig.3 Changes of total acid in the fermentation process of red sour soup

2.4 红酸汤发酵过程中还原糖含量的动态变化

图4 红酸汤发酵过程中还原糖含量的变化Fig.4 Changes of reducing sugar content in the fermentation process of red sour soup

成熟的番茄果实内含有果糖和葡萄糖[20]，而果糖与葡萄糖均属于还原糖，乳酸菌利用还原糖产生乳酸等代谢产物，产生独特芳香及风味物质[21]。由图4可知，随着发酵时间的延长，两组红酸汤还原糖含量都在不断地降低，在发酵第1天时，还原糖含量出现上升趋势，是因为番茄中的双糖、三糖和多糖水解成还原性糖溶解到酸汤发酵液中，而微生物还处于适应阶段，其溶出速度大于微生物的利用速度；从发酵的第2天开始，还原糖含量迅速下降，说明还原糖开始被乳酸菌利用，且还原糖利用效率远高于还原糖溶出效率，所以还原糖由最初的(25±0.054) mg/mL下降到第5天的(5±0.071) mg/mL左右，随后仍然在缓慢的下降，直至利用完全。

2.5 红酸汤发酵过程中氨基酸态氮含量的动态变化

氨基酸作为发酵食品一个重要的评价指标和风味物质的前体物质，理论上通常采用氨基酸态氮的含量来表示。氨基酸种类和含量不仅能够影响发酵蔬菜的品质，且通过化合反应产生的风味物质对发酵蔬菜的品质存在很重要的作用[22]，如食品中主要鲜味氨基酸：天冬氨酸和谷氨酸，能够与Na+结合形成鲜味物质，对红酸汤的风味和品质起重要的作用[23]。由图5可知，在两组红酸汤的整个发酵过程中，无论是否接菌发酵，酸汤总氨基酸态氮含量呈现不规则波动的趋势，在发酵后期，接菌组的氨基酸态氮含量明显高于未接菌组。有文献报道，蛋白质通过微生物发酵后分解成人体更易吸收的氨基酸，提高人体对蛋白质的利用效率[24]。

图5 红酸汤发酵过程中氨基酸态氮含量的变化Fig.5 Changes of amino acid nitrogen content in the fermentation process of red sour soup

2.6 红酸汤发酵过程中亚硝酸盐含量的动态变化

图6 红酸汤发酵过程中亚硝酸盐含量的变化Fig.6 Changes of nitrite content during the fermentation of red sour soup

发酵制品中最需要关心的安全指标之一就是亚硝酸盐含量。众所周知，亚硝酸盐会对人体产生多种危害，主要包括引发高铁红蛋白症和形成致癌物质亚硝胺[25]。大量研究证实，蔬菜腌渍过程中亚硝酸盐含量均呈先增加后减少的变化趋势，且都会出现NO2-高峰即亚硝峰现象[26]。由图6可知，未接菌组在整个发酵过程中，其亚硝酸的波动较大，可能是由于各种菌相互作用引起的，而接菌组的亚硝峰则出现在第3天，之后便趋于稳定，在整个发酵过程中，接菌发酵的亚硝酸盐的含量比未接菌组要低，从而保证了红酸汤的安全性。

2.7 红酸汤发酵前后有机酸的变化

图7 红酸汤发酵前后有机酸的变化

新鲜番茄中的酸味主要归因于柠檬酸和苹果酸，占番茄总有机酸含量的90%[27,28]；有机酸不仅是发酵程度的重要指标，也是红酸汤中的主要风味营养物质之一和天然防腐剂，其含量的高低与红酸汤的品质有密切关系。生番茄经过乳酸菌发酵后，生成了口味更加柔和以及对人体更有益的乳酸[29]；研究证实乳酸可以提高人体对钙、铁的利用[30]，促进铁和维生素D的吸收。由图 7可知，通过发酵，两组酸汤中的乳酸含量都显著增加，但接菌组的乳酸增加量为未接菌组的1倍左右。

2.8 红酸汤发酵前后风味物质的变化

图8 红酸汤发酵前后风味成分的变化Fig.8 Changes of flavor components before and after fermentation of red sour soup

图9 红酸汤风味成分PCA分析图Fig.9 PCA analysis chart of flavor components of red sour soup

风味物质是衡量发酵食品品质的重要指标之一，酸汤在发酵过程中，各种物质在微生物的作用下通过各种代谢途径转化为新的代谢物，形成独特的风味；通过 GC-MS 分析，从接菌发酵组和未接菌组中共检测出75种风味物质；且两组红酸汤中主要的挥发性风味物质均为醇类、酯类、烯烃类。由图 8可知，两组酸汤通过发酵后，醇类是红酸汤中含量最高的风味物质，而醇类物质可以和有机酸在酯酶的作用下生成酯类物质[31]，醇类物质还能和甘油酯或乙酰辅酶A 在酰基转移酶或酯酶的作用下合成酯类物质[32]，而未接菌组中的醇类、酸类等物质含量较接菌组多，可能是由于未接菌组酸汤中杂菌较多，产生的代谢物质比较复杂且不稳定；酸汤中相对含量增加最多的物质是酯类，酯类物质为风味成分中重要的成分，具有水果香[33]。由于酯类物质的风味阈值较低，气味活度值相比其他物质较高，所以对发酵风味的贡献较大，由图 9中PCA分析图可知，接菌组与未接菌组在PC1(66.8%)的正轴，而未发酵组位于PC1的负轴，说明发酵后的番茄酸汤风味与未发酵的番茄风味差异显著，其中，酸类、醇类、酯类和醛酮类对接菌组和未接菌组的风味影响较大。

3 结论

本实验通过对其发酵过程中与营养品质相关的指标进行测定及分析，并对其发酵前后的有机酸的变化和风味物质的变化进行测定及分析，结果表明本实验所采用的这两株乳酸菌能够很好地适应红酸汤的发酵环境并快速产酸，将红酸汤发酵周期由15 d缩短至5 d，而相应的营养及安全指标得到提升，如氨基酸态氮含量与乳酸含量显著高于未接菌发酵组，亚硝酸盐含量显著低于未接菌发酵组；且通过发酵前后有机酸以及风味物质的数据可知，接菌发酵组的有机酸中乳酸含量超过未接菌组的1倍左右，风味组成及含量与未接菌组相似；表明本实验所用的两株乳酸菌可以作为红酸汤的发酵剂，且通过乳酸菌复合发酵可以改善其风味，提高其营养保健价值和安全性，可以为红酸汤产业化发展提供参考和理论依据。