陈笑钗，李婷，黄炳文，蒋予箭*

(1.浙江五味和食品有限公司，浙江 湖州 313213； 2.浙江工商大学食品与生物工程学院，杭州 310018)

浙江玫瑰米醋因色泽艳如玫瑰而得名，传统工艺采用固态糖化和表面静置液态发酵，其酸味柔和绵长，鲜而微甜，醋香纯正。存在发酵周期长、机械化程度低、生产效率不足等问题。传统玫瑰醋酿造中，醋酸的形成主要在表面静置发酵的醋酸发酵阶段[1]，也是玫瑰醋色泽及风味的主要形成时期，同时各种醇类、有机酸、酯类等呈味物质也在此阶段生成[2]。包括前期糖化、酒精发酵在内的整个发酵时间持续120 d左右，酸度达4.5～5.0 g/dL，缩短发酵时间提高发酵原料转化率、保持特色风味是目前玫瑰醋工艺改良的方向。以补料发酵应用于浙江玫瑰醋传统工艺的醋酸多菌种混合发酵过程中，可以控制中间代谢，避免发酵中因糖量过多造成菌体大量生长，提高底物到产物的转化率[3]。根据玫瑰醋生产中涉及的发酵工程原理，补料途径主要流程见图1。

图1 补料途径流程图Fig.1 Flow chart of fed-batch pathway

目前将补料技术应用在食醋酿造领域的理论研究和生产实践的相关报道较少，主要应用于产高醋酸的深层液态发酵醋。熊贤平等[4]研究了高酸度饮料用苹果醋的分割补料酿造工艺，发现发酵菌种耐受初始酒精浓度与醋酸浓度分别不宜超过6.5%(V/V)和3.0 g/dL，确定须采用分割体积补料发酵方式才能获得总酸≥7.0 g/dL饮料用苹果醋。张阳等[5]采用亚甲基蓝还原法研究了酒精分批发酵过程中的酵母活力，以确定最佳补料时间，旨在为木薯等淀粉质原料的补料发酵提供理论依据。

本文在玫瑰醋经过糖化阶段和酒化基本完成的发酵过程后，对浙江玫瑰醋的醋酸发酵阶段进行补料，从补料时间、补料量、补料次数、发酵温度的工艺条件出发，保持恒定总体积发酵，在单因素试验基础上，利用Box-Behnken中心响应面法对玫瑰醋醋酸发酵的补料工艺参数进行优化[6-8]，以期得到最佳补料发酵工艺，为提高生产效率提供了理论基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 黄酒发酵醪液(补料用)

酒精度14%～16%(V/V)，糖度5%～8%，总酸0.2～0.3 g/dL，发酵时长7 d左右，湖州老恒和酿造有限责任公司提供。

1.1.2 菌种

暂名为HZ03，于2016年6月从传统发酵玫瑰醋生产车间的表层发酵醪中分离筛选得到，30 ℃培养48 h，由其形态可知为醋酸杆菌，产酸速率为(0.063±0.002) g/dL·h，由本校生物工程系发酵实验室保存；扩培培养基：葡萄糖1%，酵母粉1%，取50 mL分装到200 mL的三角瓶中，121 ℃灭菌20 min，使用前加入3%无水乙醇[9]。

1.1.3 玫瑰醋液态发酵醋醪液

经固态糖化15 d后冲缸放水，发酵至一定初始酸度的醪液，湖州老恒和酿造有限责任公司提供。

1.1.4 其他

葡萄糖、酵母粉、无水乙醇、氢氧化钠、氯化钠、酚酞：均为分析纯。

1.2 主要仪器和设备

AR-2140型电子分析天平 奥豪斯国际贸易有限公司；SPX-250B-Z型隔水式恒温培养箱 上海精密仪器仪表有限公司；pHS-3C型酸度计 梅特勒-托利多仪器有限公司；SW-CJ-1FD型超净工作台、YXQ-LS-SII型立式压力蒸汽灭菌器 上海博迅实业有限公司医疗设备厂。

1.3 实验方法

1.3.1 玫瑰醋的补料发酵工艺

1.3.1.1 醋酸菌的扩大培养

接种的菌种HZ03，不氧化醋酸，发酵液香味柔和。将保存菌种接种到扩大培养基中，30 ℃培养48 h，用无菌生理盐水稀释，使其在波长600 nm处的OD值为0.5[10]，按10%的比例添加到发酵培养液中。

1.3.1.2 醋酸发酵的补料操作

将传统玫瑰醋发酵醪液酒精发酵基本结束后，接入10%醋酸菌，总装液量为200 mL/L，保持控制温度为30 ℃。当发酵进行到一定阶段后，每隔一定时间放出一定体积的发酵液，然后补入等体积的后发酵黄酒补液(初始酒精度调整为6%)，然后盖上6层纱布，不仅保证醋酸菌好氧发酵的环境，而且可以防止其他杂菌污染，如此反复发酵。过程中主要涉及的反应方程式为：

1.3.1.3 玫瑰醋补料工艺参数优化路线

1.3.2 玫瑰醋发酵工艺的单因素试验

选取补料时间(底液初始酸度达到0.5,1.5,2.5,3.5,4.5 g/dL)、补料体积分数(33%、50%、67%)、补料次数(1,2,3,4,5次)和发酵温度(26,28,30,32,34 ℃)4个因素，测定醋酸发酵基本结束时，玫瑰醋补料能达到的最高酸度。

1.3.3 玫瑰醋补料发酵工艺的Box-Behnken响应面试验设计

在单因素试验的基础上，选取影响较为明显的单因素为自变量，以发酵最高酸度为响应值，根据响应面设计中的Box-Behnken中心组合设计原理，采用Design-Expert 8.0.6响应面设计软件进行试验设计，共进行17组实验，每组实验重复测定3次，最后确定最佳优化条件。Box-Behnken中心组合设计的因素水平及编码水平见表1。

表1 Box-Behnken中心组合设计的因素水平Table 1 Factors and levels of Box-Behnken central composite design

1.3.4 测定方法

1.3.4.1 酒精度测定

采用蒸馏法，参照GB/T 13662-2008进行分析。

1.3.4.2 酸度测定[11]

采用酸碱滴定法，在烧杯中准确吸取1 mL样品，加80 mL蒸馏水，在磁力搅拌器上搅拌均匀，边搅拌边用0.05 mol/L的NaOH溶液滴定至pH 8.20为止，对消耗的NaOH体积数进行读数。平行测定3次，取平均值。

2 结果与分析

2.1 补料时间点对玫瑰醋醋酸发酵的影响

图2 不同补料时间点对醋酸发酵过程总酸生成的影响Fig.2 Effect of different fed-batch time on total acid production during acetic acid fermentation

补加时间过早，补加酒液使原料中酒精含量过高而抑制醋酸菌的生长及代谢[12]。由图2可知，随补料时间点延后，醋酸发酵结束时的最高产酸量先升高后降低。因为在低初始醋酸浓度下补料，有利于醋酸菌的生长，与传统发酵过程对比，提高了其产酸能力，赵会芳、亓元正、高晓娟[13-15]都发现，初始酸度1.0 g/dL时对菌体产酸速率有明显促进作用，为了充分发挥醋酸菌的产酸活性，保持一定低浓度的初始醋酸底物很有必要。而补料时间太迟，发酵液中酒精消耗，有毒(害)代谢物质开始积累，醋酸菌出现衰亡。在初始酸度3.5 g/dL时补料，最终产酸量达到最高(4.88±0.35) g/dL。因此，按发酵液酒精度不再上升，醋酸发酵至不同初始酸度(1.5,2.5,3.5 g/dL)为响应面的取值范围。

2.2 补料量对玫瑰醋醋酸发酵的影响

图3 不同补料量对醋酸发酵过程总酸生成的影响Fig.3 Effect of different fed-batch amount on total acid production during acetic acid fermentation

以发酵底液初始酸度达到1.5 g/dL为补料时间点，改变补料体积，考察醋酸发酵结束时可生成的总酸量。由图3可知，3个不同补料量均能提高产酸量，可用来进行响应面分析。经过预实验，在一定补料体积范围内，少量补料能加快醋酸发酵进程，有利于酒精转化为醋酸；补料量增加，酒精醪液补充过多，酒精浓度过高，反而会抑制醋酸菌的生长。故补料体积选择33%、50%、67%较为合适。

2.3 补料次数对玫瑰醋醋酸发酵的影响

图4 不同补料次数对醋酸发酵过程总酸生成的影响Fig.4 Effect of different fed-batch times on total acid production during acetic acid fermentation

选择补料量为50%后，分不同次数将黄酒后发酵液补加进醋酸发酵醪继续发酵，探究不同补料次数对醋酸发酵过程最终总酸量生成的影响。由图4可知，补料0次即为传统发酵对照，补料1次最终能达到的最高酸度比较高，且随着补料次数的增加，总酸生成量越低。可能原因是，玫瑰醋生产采用表面液态发酵，在空气及液体交界处形成菌体大量集中的细菌纤维素膜，有助于耗氧代谢及传质，要尽量保证发酵表面菌膜的完整性，发酵才能顺利进行，短时间内补料多次不利于表面菌膜的形成和醋酸菌的富集，醋酸生成量受到影响。结果表明，醋酸发酵中补酒液1次可以提高最终产酸量，补料次数增加反而影响醋酸的生成。

2.4 发酵温度对玫瑰醋醋酸发酵的影响

图5 不同发酵温度对补料发酵酸度变化的影响Fig.5 Effect of different fermentation temperatures on fed-batch fermentation acidity

温度不仅直接影响由乙醇转变成乙酸的生物氧化速度，而且会影响发酵副产物的代谢平衡，间接影响玫瑰醋芳香物质的形成和口感，所以在发酵参数的控制中要对温度重点关注[16，17]。以不同的发酵温度(26，28，30，32，34 ℃)研究，其中28 ℃基本接近研究环境的常温，底料初始酸度达到2.5 g/dL、补料量为1/2体积的条件下，由图5可知，在26～32 ℃条件下，随发酵温度的上升，酸度明显上升，26 ℃时发酵前6 d酸度上升缓慢，之后上升但酸度明显低于其他组，表明温度过低，醋酸菌生长缓慢，无法将酒精及时发酵为醋酸。30 ℃和32 ℃能达到的最高酸度较其他温度要高，显然在一定温度范围内，醋酸菌的生长繁殖随温度的上升而增加。当温度上升到34 ℃时，醋酸菌的生长代谢会受到高温影响，产酸效率降低，另外，随着温度的升高，酒精的挥发程度加重，这也会导致醋酸菌对酒精利用率的下降。因此，选择28，30，32 ℃进行响应面分析较为合适。

发酵温度对最高酸度的影响曲线见图6。

图6 发酵温度对最高酸度的影响曲线Fig.6 Curve of the effect of fermentation temperature on the maximum acidity

2.5 Box-Behnken中心响应面法优化补料发酵参数

2.5.1 补料发酵响应面模型的建立及显著性分析

通过探究4个单因素(补料时间点、补料量、补料次数、发酵温度)对玫瑰醋醋酸形成的影响，选择补料时间点(初始酸度达到1.5，2.5，3.5 g/dL)、补料量(33%、50%、67%)、发酵温度(28，30，32 ℃)进行三因素三水平的响应面模型设计及参数优化。

利用Design Expert 8.0.6软件设计三因素三水平的响应面试验，响应面试验设计及结果见表2。

表2 浙江玫瑰醋的补料发酵最优补料条件响应面试验设计方案及试验结果Table 2 Design and results of response surface test for optimal fed-batch fermentation conditions of Zhejiang rose vinegar

对表2的数据进行多元回归拟合，对响应值进行回归分析后建立玫瑰醋醋酸发酵过程补料工艺的参数回归模型，回归方程为：

Y=4.93+0.25A-0.044B+0.12C-0.09AB+0.3AC-0.18BC-0.61A2-0.15B2-0.21C2。

为了验证玫瑰醋补料发酵工艺的参数回归模型的可靠性，对回归方程进行方差分析，结果见表3。

表3 玫瑰醋补料工艺条件回归模型方差分析表Table 3 Variance analysis table of regression model for fed-batch process conditions of rose vinegar

注：P<0.01表示差异极显著，用“**”表示；P<0.05表示差异显著，用“*”表示；P>0.05表示差异不显著。

由表3可知，模型极显著(P<0．001)，失拟值不显著(P>0．05)，说明该回归方程的拟合效果好，此外变异系数(C.V.，%)为1.74%，相对较低的值也表明模型具有更好的精度，试验设计方案具有可操作性。二次项A2、B2、C2显著，说明对响应值有极显著影响。A，B，C 3个因素对响应值的影响效果大小为：A>C>B。R2为0.9754>0.9，说明此模型具有可靠性，RAdj2=0.9438，说明此模型可以解释大约94.38%响应值的变化，因此回归方程的拟合程度较好。所以试验结果与预测值之间具有良好的拟合度，可以用此参数回归模型来对玫瑰醋的补料发酵过程进行分析和预测。

2.5.2 补料发酵参数响应面及等高线分析

响应表面图用于研究两因素之间的相互作用对于醋酸发酵过程最终产酸量的影响。三维(3D)响应面预测模型和二维轮廓图见图7。

轮廓图的形状近似椭圆形，表明初始酸度与补料量之间相互作用显著。初始酸度和发酵温度交互作用显著，由图7可知，随着补料初始酸度的增大，补料量呈现先增加后减少的趋势；随着补料量的增加，发酵温度略微上升；随着初始酸度的增大，发酵温度呈增大的趋势。

图7 补料时间、补料量和发酵温度的交互作用对最高产酸量影响的响应面和等高线Fig.7 Response surface plots and contour lines of effects of interaction between fed-batch time, fed-batch volume and fermentation temperature on the maximum acid yield

基于以上实验数据，该模型预测在最佳工艺条件下，玫瑰醋补料发酵可提高产酸量最高达到5.55 g/dL：补料初始酸度达到2.85 g/dL，补料量33%，发酵温度32 ℃。在最佳条件下进行5个平行实验，验证模型的充分性，最高酸度达到(5.59±0.27) g/dL，与预测数据吻合良好。

3 结论

本研究以补料发酵工艺用于浙江玫瑰醋传统工艺的改良，采用单因素试验和响应面分析法优化补料发酵工艺参数，得出最佳工艺参数为：补料时间在底液初始酸度达到2.85 g/dL，补料体积为33%，控制发酵温度为32 ℃，补料次数对最终产酸量影响不显著，为提高效率，选择一次补料，此时醋酸发酵结束时，玫瑰醋最高产酸量为(5.59±0.27) g/dL，其感官、理化指标和微生物指标都接近传统发酵玫瑰醋。

通过对玫瑰醋补料发酵工艺的研究，探索不同发酵条件对发酵进程的影响，为补料发酵用于改良玫瑰醋生产的研究，为后续工厂中试缩短发酵周期，提高生产效率提供了理论基础。研究此方法在玫瑰米醋生产中的可行性，可实现一年四季均能连续生产，不受季节限制，为后续借鉴黄酒机械化连续蒸饭、糖化、酒精发酵，建立浙江玫瑰米醋机械化生产线提供了理论依据。