喷施不同形态锰肥对叶用油菜镉累积及亚细胞分布的影响

2019-08-26闫秀秀徐应明陶雪莹孙约兵梁学峰

农业环境科学学报 2019年8期

闫秀秀，徐应明，王林*，陶雪莹，孙约兵，梁学峰

（1.农业农村部环境保护科研监测所，天津 300191；2.农业农村部产地环境污染防控重点实验室，天津 300191）

镉（Cd）是对人体健康威胁最大的重金属元素之一，而蔬菜是人体膳食Cd摄入的主要来源之一[1]。近年来的调查显示，我国部分城市郊区蔬菜Cd含量超标率较高，严重影响了农业安全生产[2-3]，因此，有必要采取有效措施切实降低蔬菜Cd累积。近年来，筛选和应用具有低量积累Cd特征的作物品种即Cd低积累品种，已成为安全利用Cd污染土壤的有效方法之一[1，4]。考虑到作物基因型和土壤环境对作物Cd累积均有显著影响[5]，在单独使用低积累品种仍无法满足安全生产要求时，则有必要采取调控措施，进一步减少作物Cd吸收。

锰（Mn）是植物必需的微量元素之一，由于植物吸收转运Mn2+和Cd2+会使用相同的载体蛋白如NRAMP和ZIP等，因此二者在植物体内的累积常表现出拮抗作用[6-7]。基于这种拮抗作用，许多研究通过施用Mn肥来降低作物Cd累积。例如，Huang等[8]研究发现，喷施或土施EDTA·Na2Mn均能显著降低两种水稻的稻米Cd含量，其中土施处理降低效果更好，最大降低率可达78.6%；而土施MnSO4对两种水稻籽粒Cd含量有不同影响，其中Jinzao47没有显著变化，而Zhongjiazao32则显著升高。尹晓辉等[9]研究表明，施用螯合锰、碳酸锰以及硫酸锰对水稻糙米Cd含量有不同降低效果，基施和喷施联合措施的抑制效果明显优于单一措施。综合上述研究可知，施用Mn肥调控作物Cd累积的效果与施肥种类、方法以及作物品种等都有密切关系。因此，要使施用Mn肥成为调控Cd低积累品种安全生产的有效方法，有必要根据具体品种开展Mn肥施用方法研究。

近年来，本团队通过盆栽和小区试验从35个叶用油菜（Brassica chinenesis L，以下简称油菜）品种中筛选了2个Cd低积累品种，并初步揭示了其低量吸收Cd的机理[10]。在此基础上，本研究选择Cd低积累油菜和普通油菜各1种，通过盆栽试验，研究叶面喷施不同浓度的 MnSO4、Mn（CH3COO）2以及 EDTA·Na2Mn对油菜生长和Cd、Mn含量的影响，确定降低油菜Cd含量的最佳Mn肥施用方法，同时通过分析Cd在油菜体内吸收转运规律以及亚细胞分布特征来探讨其作用机理，以期为喷施Mn肥降低油菜Cd含量提供技术支持。

1 材料与方法

1.1 实验材料

供试土壤取自河南济源市某Cd污染农田，土壤类型为潮土，其基本理化性质如下：pH值7.65，阳离子交换量13.38 cmol·kg-1，有机质含量 7.01 g·kg-1，碱解氮含量 81.39 mg·kg-1，有效磷含量 23.65 mg·kg-1，速效钾含量 93.23 mg·kg-1，Cd、Mn 总量分别为 2.54 mg·kg-1和443.42 mg·kg-1，Cd、Mn有效态含量（DTPA法浸提）分别为1.36 mg·kg-1和15.17 mg·kg-1。

供试油菜品种为前期研究筛选的Cd低积累品种华骏和普通品种寒绿[10]，油菜种子由天津市农业科学院提供。供试Mn肥包括硫酸锰（MnSO4·H2O）、乙酸锰[Mn（CH3COO）2·4H2O]以及乙二胺四乙酸二钠锰（EDTA·Na2Mn），其中前两者为分析纯，购自国药集团化学试剂有限公司，后者纯度高于95%，购自TCI公司。

1.2 实验处理与方法

本实验采用三因素完全组合设计。第一个因素为油菜品种，设置2种油菜。第二个因素为Mn肥形态，设置3种Mn肥。第三个因素为喷施Mn肥的浓度，每种Mn肥分别设置3个水平，其中，硫酸锰喷施浓度为：0.2、0.4、0.6 g·L-1（以Mn计，下同），分别记作：Mn-S1、Mn-S2、Mn-S3；乙酸锰喷施浓度为：0.1、0.2、0.3 g·L-1，分别记作：Mn-A1、Mn-A2、Mn-A3；螯合锰（EDTA·Na2Mn）浓度为：0.1、0.2、0.3 g·L-1，分别记作：Mn-E1、Mn-E2、Mn-E3；另外设置对照处理（CK），喷施去离子水。本实验共有20个处理，每个处理设置3次重复。

盆栽实验于2018年5—7月在玻璃温室内进行，室内温度为20～30℃，自然光照，盆栽器皿按随机区组排列。供试土壤风干后过5 mm筛，然后装入塑料盆中（直径22 cm，高13.5 cm），每盆装土2.0 kg，同时施入分析纯 CO（NH2）2（N 150 mg·kg-1）和 K2HPO4（P2O5206 mg·kg-1，K2O 277 mg·kg-1）作为底肥。拌土后每盆加入500 mL去离子水，密封平衡7 d，然后播种，待幼苗长至4片真叶时每盆间苗至5株。在油菜生长过程中每日以去离子水浇灌，控制土壤含水量为田间持水量的70%左右。在油菜撒播后第30、35、40 d进行喷施处理，采用微型喷雾瓶，每盆每次喷施10 mL溶液。油菜播种45 d后收获。

1.3 样品处理与分析

收获的油菜样品分为地上部和根部，样品使用去离子水和超纯水洗净，吸干水分，称取鲜质量，部分地上部样品经液氮冷冻后储存在-80℃冰箱备用。剩余地上部和全部根部样品在95℃杀青30 min，70℃烘干至恒质量，称量干质量，粉碎混匀，加入浓HNO3（优级纯），在电热板上进行消解，80℃加热1.5 h，120℃加热1.5 h，150℃加热3 h，180℃赶酸。消解后样品的Cd和Mn含量使用电感耦合等离子体质谱仪（ICP-MS，ICAPQc，Thermo Fisher Scientific）测定[11]，采用美国国家标准与技术研究院提供的菠菜叶标样SRM1570a作为油菜元素含量分析的质控样品，Cd和Mn的回收率均在95%～105%范围内。土壤基本理化性质按照土壤农化常规分析方法测定[12]。

采用离心法分离地上部样品的亚细胞组分[13]。准确称取4.00 g冷冻保存的地上部样品置于预冷的研钵中，加入40 mL预冷的提取液（蔗糖250 mmol·L-1，Tris-HCl 50 mmol·L-1，DTT 1 mmol·L-1，pH 7.5），研磨匀浆，然后用80m孔径的尼龙筛网过滤，并用提取液冲洗两次，所得滤渣即为细胞壁组分。所得滤液在20 000 r·min-1下离心45 min，上清液和沉淀分别为可溶组分和细胞器组分。以上操作均在4℃下进行。将3个亚细胞组分完全转移至消解管中，在电热板上蒸干，然后采用浓HNO3消解，ICP-MS测定Cd和Mn含量。

1.4 数据分析及统计

总Cd累积量（μg·株-1）=植物地上部Cd含量×植物地上部干质量+植物根部Cd含量×植物根部干质量。该指标表征植物根部对Cd的吸收能力[14]。

Cd转运系数=植物地上部Cd含量/植物地下部Cd含量。该指标反映植物由根部向地上部转运Cd的能力[15]。

实验数据采用SPSS 20软件进行统计分析。采用单因素方差分析和Duncan′s新复极差法分析同一品种不同处理间的差异显著性，采用Pearson相关系数法分析不同参数间的相关性。

2 结果与分析

2.1 喷施Mn肥对油菜生物量的影响

如图1（a）所示，不同Mn肥处理对油菜地上部生物量的影响与供试品种有关。就普通品种寒绿来说，与CK处理相比，Mn-A3和Mn-E3处理下油菜地上部生物量显著降低（P＜0.05），降幅分别为30.4%和45.8%。对于低积累品种华骏，喷施Mn肥对其地上部生物量无显著影响。由图1（b）可知，喷施Mn肥对两种油菜根部生物量均无显著影响。总体来看，寒绿油菜对喷施Mn肥较为敏感，喷施高浓度Mn肥会抑制其地上部生长。

图1 不同Mn肥处理下油菜干生物量Figure 1 Dry biomass of pak choi under different Mn treatments

2.2 喷施Mn肥对油菜体内Cd含量的影响

由图2（a）可知，喷施Mn肥对两种油菜地上部Cd含量的影响不同。对于寒绿，喷施3种Mn肥均使其地上部Cd含量降低。其中，在喷施硫酸锰处理组，Mn-S1和Mn-S2处理下油菜地上部Cd含量显著降低，与CK相比，降幅分别为40.0%和38.0%；在喷施乙酸锰处理组，3个浓度的处理均使地上部Cd含量显著降低，降幅范围为30.0%～39.0%；在喷施螯合锰处理组，Mn-E2和Mn-E3处理下油菜Cd含量显著降低，降幅分别为16.0%和38.0%。对于华骏，在喷施硫酸锰处理组，Mn-S2和Mn-S3处理使其地上部Cd含量显著降低，与CK相比，降幅分别为29.2%和20.0%；在喷施乙酸锰处理组，只有Mn-A2处理降低效果显著，降幅为31.0%；在喷施螯合锰处理组，Mn-E2和Mn-E3处理下油菜Cd含量呈现升高趋势。总之，从作用显著性和降幅来看，喷施Mn肥对寒绿地上部Cd含量的降低效果优于华骏。

图2 不同Mn肥处理下油菜Cd含量（干基）Figure 2 Cd concentrations（dry weight basis）in the shoots and roots of pak choi under different Mn treatments

由图2（b）知，喷施不同形态的Mn肥对两种油菜根部Cd含量均有显著影响。对于寒绿，与CK相比，所有喷施硫酸锰和乙酸锰处理均使其根部Cd含量显著降低，降幅范围分别为22.1%～56.1%和35.3%～46.6%；在喷施螯合锰处理组，在Mn-E2和Mn-E3处理下油菜根部Cd含量显著降低，降幅分别为22.0%和25.0%，而Mn-E1处理则使Cd含量显著升高。对于华骏，喷施硫酸锰和乙酸锰均使其根部Cd含量显著降低，最大降低率分别为48.7%和56.0%；在喷施螯合锰处理组，Mn-E1和Mn-E2处理下根部Cd含量显著降低，降幅分别为35.8%和30.9%。对比不同Mn肥处理下油菜地上部和根部Cd含量的变化规律可知，喷施Mn肥对油菜根部Cd含量的影响要强于地上部。

2.3 喷施Mn肥对油菜总Cd累积量和Cd转运系数的影响

植物地上部Cd含量主要受根部吸收和根部向地上部转运两个过程控制，在本研究中分别采用总Cd累积量和Cd转运系数两个指标来表征这两个过程。由图3（a）知，对于寒绿，与CK相比，除Mn-E1外，其余Mn肥处理均使总Cd累积量显著下降，降幅范围为15.1%～65.0%。这表明喷施Mn肥可以有效降低寒绿根系对Cd的吸收；而与CK相比，寒绿的Cd转运系数在Mn-S2和Mn-A3处理下显著提高。由图3（b）可知，对于华骏，在Mn-S2和Mn-A2处理下总Cd累积量与CK相比显著降低，降幅分别为32.0%和49.2%；华骏的Cd转运系数在Mn-S1、Mn-S3、Mn-A1、Mn-A2以及Mn-E2处理下显著增加。

相关性分析表明，两种油菜的地上部Cd含量与总Cd累积量都呈极显著的正相关性（P＜0.01），相关系数分别为0.838（寒绿）和0.867（华骏）；油菜地上部Cd含量与Cd转运系数的相关系数分别为-0.030（寒绿）和-0.124（华骏）（P＞0.05），均无显著相关性。另外，对比两种油菜地上部Cd含量、总Cd累积量以及Cd转运系数的变化规律可知，地上部Cd含量与总Cd累积量变化趋势一致。由此可知，本研究中喷施Mn肥主要是通过抑制油菜根部Cd吸收，来降低地上部Cd含量。

2.4 喷施Mn肥对油菜体内Mn含量的影响

由表1可知，喷施不同形态的Mn肥可显著提高油菜体内Mn含量。就地上部来说，对于寒绿，除了Mn-A1、Mn-E1和Mn-E2处理外，其他处理的地上部Mn含量均显著增加，增幅为CK组的3.56～8.59倍；对于华骏，除了喷施螯合锰处理组，其他Mn肥处理都使其地上部Mn含量显著提高，最大增幅为CK组的13.27倍。对比相同浓度Mn处理下两种油菜地上部Mn含量可知，3种Mn肥对油菜地上部Mn含量提高效果的顺序为硫酸锰＞乙酸锰＞螯合锰。对于根部，与CK比较，在Mn-S2、Mn-S3、Mn-A2及Mn-E2处理下，寒绿根部的Mn含量显著提高，而华骏则在Mn-S3、Mn-A3以及Mn-E3处理下，根部Mn含量显著增加。这表明喷施Mn肥后，油菜地上部吸收的Mn可以转运到根部。

2.5 喷施Mn肥对油菜Cd亚细胞分布的影响

由表2可知，对于寒绿，除了Mn-S3、Mn-A3、Mn-E1处理外，其余Mn肥处理的细胞壁组分Cd含量与CK相比均显著降低，降幅范围为30.3%～83.1%；对于细胞器组分，除了Mn-E1处理，其余Mn肥处理的Cd含量与CK相比均显著降低，降幅范围为48.6%～83.1%；对于可溶组分，在Mn-E1处理下，其Cd含量比CK显著升高，增幅为90.4%，其余处理下则没有显著变化。就Cd的分配比例来看（图4），在喷施硫酸锰和乙酸锰处理组，细胞器组分Cd的分配比例明显降低，降幅为6.5%～11.3%，可溶组分比例则明显升高，增幅为9.0%～33.6%；在喷施螯合锰处理组，细胞壁和细胞器组分Cd的分配比例都明显降低，二者最大降幅分别为22.8%和12.4%，可溶组分比例则明显升高，最大增幅为33.6%。

图3 不同Mn肥处理下油菜总Cd累积量和Cd转运系数Figure 3 Total Cd accumulation and Cd transfer factor of two cultivars of pak choi under different Mn treatments

表1 不同Mn肥处理下两种油菜体内Mn含量（mg·kg-1，干基）Table 1 Mn concentrations in two cultivars of pak choi under different Mn treatments（mg·kg-1，dry weight basis）

对于华骏，细胞壁组分Cd含量在喷施3种Mn肥后均显著降低，降幅范围为31.3%～59.5%；喷施Mn肥对细胞器组分Cd含量没有显著影响；对于可溶组分，喷施Mn-E3处理下其Cd含量比CK显著升高，增幅为92.0%，其余处理下则没有显著变化。由图4（b）可知，对于华骏，在Mn-S2、Mn-A3以及所有螯合锰处理下，细胞壁Cd的分配比例明显降低，降幅范围为4.18%～26.27%，可溶组分中Cd的比例则明显升高，最大增幅为33.57%。总体来说，喷施Mn肥后两个油菜品种地上部细胞壁组分中Cd含量和分配比例呈现降低趋势，而可溶组分中Cd的比例则呈现升高趋势。

表2 不同Mn肥处理下两种油菜地上部亚细胞组分中的Cd含量（mg·kg-1，鲜基）Table 2 Cd concentrations（mg·kg-1，fresh weight basis）in three subcellular fractions in shoots of the tested pak choi cultivars under different Mn treatments

图4 不同Mn肥处理下两种油菜地上部Cd在亚细胞组分中的分配比例Figure 4 Cd proportions in three subcellular fractions in shoots of the tested pak choi cultivars under different Mn treatments

2.6 喷施Mn肥对油菜Mn亚细胞分布的影响

两种油菜地上部Mn的亚细胞组分含量如表3所示。对于寒绿，喷施螯合锰对各亚细胞组分的Mn含量没有显著影响；而Mn-S2、Mn-S3以及Mn-A3处理下细胞壁和可溶组分Mn含量显著升高。从Mn的分配比例来看（图5），喷施Mn肥后，细胞器组分Mn的分配比例明显降低，降幅范围为3.7%～6.9%，可溶组分Mn的分配比例明显升高，增幅范围为6.8%～20.6%，部分处理细胞壁组分Mn的比例有所降低，降幅为0.8%～13.7%。对于华骏，所有硫酸锰以及Mn-A3处理下各亚细胞组分的Mn含量显著升高，而其余大部分处理对各亚细胞组分Mn含量没有显著影响。从Mn的分配比例来看，喷施Mn肥使得细胞壁中Mn的比例下降，降幅范围为0.5%～15.1%，可溶组分中Mn的比例升高，最大增幅为19.9%。总体来看，大部分螯合锰处理对各亚细胞组分Mn含量没有显著影响，而喷施高浓度硫酸锰和乙酸锰显著提高各组分Mn含量；喷施Mn肥后，油菜细胞壁Mn的比例呈现降低趋势，可溶组分Mn的比例则明显升高。

表3 不同Mn肥处理下两种油菜地上部的亚细胞组分中的Mn含量（mg·kg-1，鲜基）Table 3 Mn concentrations（mg·kg-1，fresh weight basis）in three subcellular fractions in shoots of the tested pak choi cultivars under different Mn treatments

图5 不同Mn肥处理下两种油菜地上部Mn在亚细胞组分中的分配比例Figure 5 Mn proportions in three subcellular fractions in shoots of the tested pak choi cultivars under different Mn treatments

3 讨论

Mn在植物光合作用、氮代谢以及抗氧化体系等方面发挥重要作用，Mn可以通过改善植物生理功能以及拮抗作用缓解Cd对植物的毒害作用[16]。在本研究中，喷施Mn肥对两种油菜生长没有促进作用，这可能与供试土壤的Mn有效性和Cd含量有关。本研究对照组油菜地上部Mn含量超过80 mg·kg-1，远高于植物缺Mn临界值20 mg·kg-1[17]，这表明供试土壤Mn有效性较高，从而导致施用Mn肥的肥效不佳；而土壤Cd含量为2.54 mg·kg-1，对照组中油菜生长没有受到明显抑制，因此通过Mn/Cd拮抗缓解植物Cd毒害的作用也未得以体现。另外，Mn也是一种重金属元素。施用高剂量Mn肥会使植物累积过量的Mn，进而导致Mn中毒，显著抑制植物生长[18-19]。Zhang等[20]研究发现，喷施0.05 g·L-1和0.5 g·L-1Mn（MnSO4）显著提高人参根部产量，而喷施5 g·L-1Mn却使其产量显著降低。本研究也表明，喷施高浓度乙酸锰和螯合锰显著降低了寒绿的地上部生物量。值得注意的是，在本研究中，乙酸锰和螯合锰处理组Mn的喷施浓度比硫酸锰低1倍，但是前两者的高浓度处理使寒绿的地上部生物量显著降低，后者却没有显著影响，究其原因可能与伴随阴离子不同有关。Huang等[8]研究发现，喷施0.1 g·L-1Mn的MnSO4处理对水稻地上部生物量没有显著影响，而喷施相同浓度的EDTA·Na2Mn却使水稻生物量显著降低。张玉先等[21]研究也发现，喷施高浓度EDTA-Mn（7.8 g·L-1Mn）显著抑制大豆氮代谢相关指标，进而明显影响大豆产量。

在本研究中，从喷施Mn肥降低油菜地上部和根部Cd含量的效果来看，硫酸锰处理组平均降低率和最大降低率分别为34.0%和56.1%，乙酸锰处理组为34.8%和56.0%，螯合锰处理组为16.1%和38.4%。由此可知，硫酸锰和乙酸锰降低油菜Cd含量的效果明显优于螯合锰。就具体处理来说，0.4 g·L-1Mn的硫酸锰和0.2 g·L-1Mn的乙酸锰两个处理降低油菜地上部Cd含量的效果最佳。而就提高油菜地上部Mn含量的效果来看，硫酸锰和乙酸锰的效果也明显优于螯合锰。另外，相关性分析显示，油菜地上部和根部Cd含量与地上部Mn含量都呈显著的负相关关系（P＜0.05，df=58），相关系数分别为-0.579和-0.542，这表明油菜在Mn、Cd吸收过程中确实存在拮抗作用，喷施Mn肥可能通过提高油菜地上部Mn含量，降低了油菜体内Cd的累积，这一锰镉拮抗作用也是硫酸锰和乙酸锰降低油菜Cd含量的效果优于螯合锰的重要原因。近年来研究发现，NRAMP5蛋白是水稻吸收Mn和Cd的重要转运载体，而且NRAMP5基因的表达量不受生长介质中Mn浓度的影响，即使在Mn浓度较高时，其表达量也没有显著变化，这就导致其对应的载体数量有限，而过量的Mn和Cd竞争这些载体，从而造成水稻对二者的吸收表现为拮抗作用[22-23]。喷施Mn肥抑制油菜Cd吸收是否也有相同的基因调控机制，还有待进一步研究证实。

重金属的亚细胞分布与其在植物体内的累积和转运有密切的关系，它受多种因素影响，诸如元素种类与浓度、植物基因型与器官以及外源物质等[13，24]。本研究中，Cd和Mn在油菜茎叶不同亚细胞组分中的分配比例大小顺序为可溶组分＞细胞壁＞细胞器。王俊丽等[25]发现，在Cd污染土壤种植艾纳香，其茎和叶中的Cd大部分累积在可溶组分中，比例高达69.1%～95.6%。何蔚等[26]研究表明，Mn在栾树和乌桕体内主要分布在细胞可溶组分，其次为细胞壁。本研究的结果与这两个研究一致。另外，喷施Mn肥后，Cd和Mn在油菜茎叶细胞壁的分配比例呈现降低趋势，而在可溶组分的分配比例则呈现升高趋势。邓华等[27]研究发现，Mn在短毛蓼茎部细胞可溶组分的分配比例随Mn处理浓度升高而增加，从25.1%上升至58.2%，而在细胞壁中的比例则从66.5%降低至38.0%。徐向华等[28]也发现，随着Mn处理浓度的升高，商陆叶片中Mn在细胞可溶组分的比例逐步升高，而在细胞壁中的比例则有所降低。而徐莜等[29]研究发现，在培养液中添加0.8 mmol·L-1和1.6 mmol·L-1Mn会显著提高水稻地上部Cd在细胞壁中的比例，降低其在可溶组分中的比例。本研究结果与邓华等和徐向华等的研究一致，而与徐莜等的不同。研究发现，在拟南芥的液泡膜上存在多种转运Mn的载体蛋白，例如NRAMP3和CAX2，在Mn胁迫时植物会大量合成这些载体，从而向液泡内转运过量的Mn，同时这些载体也可以转运Cd[30-31]。因此我们推测油菜液泡膜上可能也存在类似的载体，在本研究中喷施Mn肥使油菜地上部Mn含量升高，会激活相关基因而导致载体大量合成，将过量的Mn转运到液泡，而转运Mn的同时部分Cd可能被协同转运，最终造成可溶组分中Mn和Cd的比例都有所提高。