彭亦谷，赵彩镯，胡 荣，马宇熙，王子荣

(新疆农业大学食品与药品学院，新疆乌鲁木齐830052)

钙是人体内必需的元素之一，它是构成人体骨骼、牙齿、器官、血液、肌肉组织的重要成分，当人体中缺乏钙可能发生生理功能障碍［1-2］。氨基酸螯合钙是一个或者多个氨基酸基团与金属钙发生配合反应形成的具有环状结构的化合物。其具有良好的化学和生化稳定性，易于被人体吸收、副作用小、生物利用率高［3-4］，能达到既补充氨基酸又补充钙的双重功效，是一种较理想的钙营养强化剂［5-6］。而蛋壳中含有丰富的钙，从畜牧学角度分析它是一种完全高度结合的生物钙源，天然、安全［7］。H．Z．Walton 对没经过水洗处理的鸡蛋壳中所含化学元素进行测定，发现其中钙含量高达36．4%［8］，并且还有一些机体必要微量元素。按蛋壳占蛋重的12%～13%［9］进行计算，近些年来我国每年扔掉的鸡蛋壳达400×104t［10］左右，对环境造成污染以及资源的极大浪费。这迫切需要新技术手段来对蛋壳进行营养资源化利用，既可以变废为宝，高价值化利用蛋壳，又可以解决蛋壳对环境造成的污染;活跃我国钙制剂市场，改善我国居民缺钙的现状。因此研究以鸡蛋壳为钙源制备谷氨酸螯合钙的技术具有较高的实际意义和开发价值。

目前，对蛋壳钙源的利用制备钙制剂主要是乳酸钙、柠檬酸钙及苹果酸钙等第二代钙制剂，主要采用酸解提取可溶性钙、高温煅烧法，方法普遍存在造成酸污染以及环境污染，有机溶剂残留等缺陷［11-12］，而本实验采用鸡蛋壳与氨基酸直接反应制取氨基酸螯合钙，这种研究方法报道较少，相对于前者具有绿色环保，工艺简便易行等优点。氨基酸螯合钙是第三代钙制剂钙元素可以通过小肠绒毛刷状缘，以氨基酸或肽的形式直接从肠黏膜吸收，有效避免一些理化因子的影响，如pH、脂类、纤维、草酸、植酸等的影响，其生物学利用率高，从而有效解决传统钙制剂产生的溶剂性差、吸收利用低、产生结石等问题。因此，本实验采用直接反应制取氨基酸螯合钙法，对摩尔比、pH、螯合温度、螯合时间4个参数进行响应面优化设计，获得最佳工艺参数，以此为鸡蛋壳的深度开发以及氨基酸螯合钙制剂的综合利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

原料 鸡蛋壳，收集于新疆农业大学学生食堂餐厅，蛋品种为海兰褐鸡蛋，收集时间清晨新鲜废弃蛋壳;L-谷氨酸 北京博泰克生物基团技术有限责任公司;无水乙醇、EDTA二钠盐、三乙醇胺 天津市福晨化学试剂厂;铬黑T 天津市致远化学试剂有限公司;盐酸 天津化学试剂三厂;氨水 四川西陇化工有限公司。

FW-100高速万能粉碎机 北京市永光明医疗仪器厂;EYELA SB2000旋转蒸发仪 上海爱朗仪器有限公司;DHG-9070A电热恒温鼓风干燥箱 上海恒科技有限公司;100目国家标准筛 上海东星建材实验设备有限公司;AL204-IC电子分析天平 上海市梅特勒-托利多有限公司;数显恒温水浴锅 北京市永光明医疗仪器厂;PHS-3c酸度计 上海仪电科学仪器股份有限公司;FOODALYT-TS10滴定仪 北京天翔飞域仪器设备有限公司。

1.2 实验方法

1．2．1 原料预处理 蛋壳收集后，清水清洗表面杂物，沸水煮沸5～10min，超声波壳膜分离，置100℃烘箱中烘干，粉碎过100目筛，4℃储存备用。

1．2．2 谷氨酸螯合钙制备工艺流程 谷氨酸、钙源蛋壳粉和蒸馏水一定比例混合→调节pH→加热→搅拌→保温螯合→抽滤→上清液减压浓缩置膏状→乙醇沉淀→离心→收集沉淀物→干燥→粉碎→谷氨酸螯合钙

1．2．3 谷氨酸螯合钙螯合率的测定 称取1．00g氨基酸螯合钙样品，溶于蒸馏水定容500mL，取100mL置300mL锥形瓶中，加入5滴1%铬黑T指示剂和NH3·H2O-NH4Cl缓冲溶液 5mL 摇匀。0．01mol/L EDTA溶液滴定，平行进行3次滴定，记下消耗的EDTA溶液平均体积V0。另取相同量氨基酸螯合钙样品，加50mL无水乙醇，充分搅拌离心、分离、烘干，用蒸馏水定容至500mL，方法同上，记下消耗的EDTA溶液平均体积V1，由此计算出螯合率和金属元素的总含量。

式中:C标定EDTA溶液的浓度mol/L;V1滴定螯合态钙元素消耗的EDTA溶液体积mL;V0滴定钙元素总量消耗的EDTA溶液体积mL;M为钙元素的相对分子量g/mol;m为称取的样品量g。

1．2．4 影响螯合率的单因素实验设计 通过单因素分别考察不同pH、摩尔配比、温度、反应时间4个主要影响因素对氨基酸螯合钙螯合率的影响，为响应面组合实验各因素水平设计提供有意义的取值范围。

1．2．4．1 摩尔比对螯合率的影响 分别以 4∶1、3∶1、2∶1、1∶1、1∶2、1∶3、1∶4、1∶5 摩尔比，在 pH7、温度 70℃的水浴中保温螯合60min，考察不同摩尔比对螯合率的影响。

1．2．4．2 pH对螯合率的影响 调节混合液pH分别为 3、4、5、6、7、8、9、10，在摩尔比为 1∶3、温度 70℃的水浴中保温螯合60min，考察不同pH对螯合率的影响。

1．2．4．3 温度对螯合率的影响 在 pH 为7，蛋壳粉与谷氨酸摩尔比为1∶3，螯合时间60min，选取螯合温度 30、40、50、60、70、80、90、100℃。

1．2．4．4 时间对螯合率的影响 在 pH7、70℃、蛋壳粉与谷氨酸摩尔比为1∶3条件下，螯合温度为30、40、50、60、70、80、90、100、110、120min 选取不同时间进行保温螯合。

1．2．5 响应面的实验设计 依据单因素实验结果，选择出最优条件范围，通过Box-Behnken Design进行实验设计，分析pH、摩尔配比、温度、反应时间对响应值的影响，得出最佳工艺参数。实验因素水平设计见表1，响应面设计数据及结果见表2。

表1 谷氨酸螯合钙响应面实验因素与水平Table 1 Experimental factors and levels

2 结果与分析

2.1 谷氨酸螯合钙制备工艺条件的单因素实验

2．1．1 蛋壳粉与谷氨基酸不同摩尔比对螯合率的影响 由图1可知，在蛋壳粉与谷氨酸摩尔比从4∶1变化到1∶3的过程中，螯合率显著增加，在摩尔比为1∶3时达到最高值;但随着摩尔比调至1∶4、1∶5时，螯合率呈下降趋势。这是因为碳酸钙与谷氨酸反应合成谷氨酸螯合钙，反应物的摩尔比理论值为1∶2，反应体系中谷氨酸与钙源蛋壳粉中的CaCO3的摩尔比高，将有利于钙离子的螯合完全，但是氨基酸利用率低，造成能源浪费，产品中钙浓度低。

2．1．2 不同pH对谷氨酸螯合钙螯合率的影响 由图2可以看出，pH对螯合率有明显影响，在pH由3上升到5过程中螯合率迅速减小，这可能是由于谷氨酸是酸性氨基酸，当其反应体系在酸性条件下时CaCO3直接先发生酸溶解反应从而有利于螯合率的提高。pH由5再上升到7时螯合率迅速增大，在pH8～10之间螯合率逐渐减低，pH为7时达到最大值，分析原因可能是当溶液中H+大量存在时，H+将会与Ca2+争夺电子基团，不利于螯合物的形成，在pH为7时，氨基酸受H+和OH-影响较小，提供了充分的供电子基团，从而有利于钙通过配位键形成螯合物［13-14］。

图1 不同摩尔比对螯合率的影响Fig．1 Effects of different molar ratio of chelating rate

图2 不同pH对螯合率的影响Fig．2 Effect of different pH on the chelating rate

2．1．3 不同温度对谷氨酸螯合钙螯合率的影响 由图3可知，随着温度的提高，螯合钙的螯合率增大，70℃时螯合率最高，但温度进一步升高，螯合率呈下降趋势，其原因可能是温度过高而引起其他复杂反应导致产品质量减少。

图3 不同温度对螯合率的影响Fig．3 Effects of different temperature on the chelating rate

2．1．4 螯合时间对谷氨酸螯合钙螯合率的影响 由图4可知，随着螯合时间的延长螯合率先增高后降低，当螯合时间为60min时，螯合率达到最大值，若时间进一步延长，螯合率有明显的降低，可能是由于搅拌作用引起螯合物的降解，导致螯合率的降低。

2.2 响应面优化实验

响应面实验结果如表2所示。

表2 Box-Behnken Design实验设计与结果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

2．2．1 模型方差分析 表2是29个实验点结果，29个实验点分为两类:一是析因点，自变量取值在A、B、C、D所构成的三维顶点，共有24个析因点;二是零点，为区域中心点，零点实验重复5次，用来估计实验误差，以得率为响应值(Y)，利用DesignExpert8．0软件进行二次多元回归拟合，分别得到表3回归方程模型方差分析及表4回归方程系数显著性分析。

表3 回归方程模型方差分析Table 3 Analysis of variance for regression equation model

由表3方差分析结果可看出，模型p＜0．0001，方程模型达到极显著，失拟 p=0．7261 ＞0．05，不显著，因此二次模型成立，应用此方程可以预测谷氨酸螯合钙的螯合率及优化工艺。对表3中数据进行回归拟合，得到自变量与螯合率率(Y)的二次多项回归方程:Y=63．95+6．55A-1．98B-2．17C-0．51D+2．86AB+1．86AC+0．74AD+1．07BC-2．64BD-0．40 CD-8．96A2-6．77B2-4．06 C2-3．69D2

表4 回归方程系数显著性分析Table 4 Significance test for each regression coefficient of developed regression equation

由表4可知，影响氨基酸螯合钙螯合率的因素主次为:摩尔比＞pH＞温度＞时间。其中摩尔比、温度及pH达到极显著程度，螯合时间为显著，且摩尔比与pH、摩尔比与温度、pH与时间，pH与温度有交互作用，达到极显著水平。

2．2．2 响应面分析 谷氨酸螯合钙制备工艺中摩尔比、温度、pH、时间4个因素之间交互作用对螯合率的影响如下。

由图5可知摩尔比与pH对螯合钙的螯合率的影响均呈抛物线形，即随摩尔比和pH同时增大，螯合率呈先增大后降低的趋势，因此在制备工艺中适当增大摩尔比和pH可以提高螯合率。从图6可以看出，随着温度和摩尔比值提高，螯合率也表现为先增大后缓慢降低，由此可见，适当的提高摩尔比及螯合温度，可以一定程度提高螯合率。在图7中，随着时间和pH的增大，螯合率达到最大值;当时间和pH继续增大时，螯合率缓慢降低，因此在实际生产中应控制pH和反应温度在最佳范围。从图8中可知，随着pH的增大和时间的延长，螯合率也不断增加，但当达到一定值时，螯合率出现有下降的趋势，控制好时间和pH的影响对实际生产有实际意义。

图5 摩尔比和pH交互影响螯合率响应面图(C=0，D=0)Fig．5 Response surface for the effect of cross-interaction between molar ratio and pH on chelating rate(C=0，D=0)

图6 摩尔比与温度交互影响螯合率响应面图(B=0，D=0)Fig．6 Response surface for the effect of cross-interaction between molar ratio and temperature on chelating rate(B=0，D=0)

图7 pH与时间交互影响螯合率响应面图(A=0，C=0)Fig．7 Response surface for the effect of cross-interaction between pHand time on chelating rate(A=0，C=0)

2.3 最佳工艺参数确定及验证性实验

通过对2．2．1中模型方差分析得出最佳的工艺参数为:氨基酸与蛋壳粉摩尔比为 3．3∶1，pH 等于 6．9，螯合温度为69．1℃，螯合时间60．1min，在此条件下螯合率为65．34%。为检验响应面法优化以鸡蛋壳为钙源谷氨酸螯合钙工艺的可靠性，采用优化后的工艺条件进行验证实验，参考实际操作，将优化后的工艺参数调整为氨基酸与蛋壳粉摩尔比为3∶1，pH等于7，螯合温度为70℃，螯合时间60min。在此最佳条件下，螯合率为(63．88 ±0．15)%，与模型预测值的误差为 1．5%，接近预测值，说明实验具有实际应用价值。

图8 pH与温度交互影响螯合率响应面图(A=0，D=0)Fig．8 Response surface for the effect of cross-interaction between pH and temperature on chelating rate(A=0，D=0)

3 结论

通过单因素实验和响应面设计，得出影响螯合率的工艺因素按主次顺序为摩尔比＞pH＞温度＞时间，制备最佳条件为:谷氨酸与蛋壳粉摩尔比为3∶1，pH等于7，螯合温度为70℃，螯合时间60min。在最优条件下，螯合率为(63．88 ±0．15)%。

本实验采用废弃鸡蛋壳这种生物组织为材料与氨基酸直接反应制取氨基酸螯合钙技术不仅螯合率较高，而且制备过程相对于高温煅烧、酸溶解法具有节能环保，可有效提高生产效率，生产成本低，市场竞争强等优势。优化的制备工艺，可用于鸡蛋壳资源利用及产业化生产，带动禽蛋壳综合利用以及钙制剂市场的发展。

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