吕男男，高芸，单忠艳

（1. 中国医科大学附属第一医院内分泌科，内分泌研究所，沈阳 110001； 2. 沈阳市第四人民医院内分泌科，沈阳 110032）

目前，甲状腺癌已成为全球范围内患病率上升最快的实体肿瘤，美国1974至2013年间甲状腺癌发病率平均每年增加3.6%，主要与乳头状甲状腺癌的增加有关［1］。乳头状甲状腺癌通常分化良好，但伴有侵袭性生长或远处转移者5年生存率仅为40%［1-3］。研究［4-5］发现，上皮间质转化 （epithelial mesenchymal transition，EMT） 参与多种肿瘤的侵袭与转移。EMT是上皮细胞失去其极性结构获得间质细胞特性，进而改变细胞间链接状态，允许细胞运动的过程。其特征性变化为细胞连接的组分E-钙黏蛋白表达的缺失，以及间质细胞成分N-钙黏蛋白的过度表达，从而使细胞获得移动能力。促炎性细胞因子肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α），是肿瘤微环境及自身免疫性疾病中重要的炎症介质，在许多实体肿瘤及肿瘤微环境中高表达［6］。TNF-α能否促进乳头状甲状腺癌侵袭转移目前尚不清楚。因此，本研究拟通过观察TNF-α对乳头状甲状腺癌细胞系TPC-1增殖和转移的影响，探讨EMT在此过程中所发挥的作用。

1 材料与方法

1.1 材料

人 重 组TNF-α购 自 美 国Invitrogen公 司；一 抗（E-cadherin，N-cadherin，Vimentin） 购自美国Santa Cruz生物技术公司；乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1系美国科罗拉多大学内分泌、糖尿病与代谢病科HAUGEN博士赠予；DMEM培养液和胎牛血清购自美国GIBCO公司；transwell小室购自美国Corning公司；Matrigel基质胶/基质膜及荧光一抗购自美国BD公司；Alexa Fluor 594标记荧光二抗购自美国Jackson ImmunoResearch公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养及分组：将TPC-1细胞置于37℃、5%CO2培养箱中，用含10%胎牛血清及青霉素 （100 U/mL） 和链霉素 （100 μg/mL） 的高糖DMEM培养液进行培养，每24 h换液1次。待细胞呈单层贴壁生长，0.25%胰蛋白酶消化传代。将TPC-1细胞随机分为TNF-α处理组和对照组，向TNF-α处理组细胞培养液中加入终浓度为20 ng/mL的TNF-α，36 h后弃除培养液，用于后续实验；对照组则不做任何处理。

1.2.2 细胞体外迁移能力实验：消化TNF-α处理组和对照组细胞，接种至12孔板 （每组6孔），数量以贴壁后铺满板底为宜。用10 μL微量加样器垂直于孔板制造细胞划痕，尽量保证各划痕宽度一致。吸去细胞培养液，用PBS冲洗孔板3次，洗去划痕产生的细胞碎片。加入无血清培养基，拍照记录。将培养板放入培养箱内，每隔4～6 h取出拍照。实验重复3次。

1.2.3 细胞体外侵袭能力实验：用50 mg/L的Matrigel胶1∶7稀释包被transwell小室 （孔径为8.0 μm） 底部的上室面，用DMEM培养液 （不含10%胎牛血清，含1%牛血清白蛋白） 重悬细胞后制成1×105/mL的细胞悬液，按每室0.5 mL接种于transwell侵袭室的上层，继续培养36 h。取出上层的小室，去除基质膜上未侵袭转移细胞，HE染色后显微镜下随机取6个高倍 （×400） 视野，计数穿过基质胶的细胞数。实验重复3次。

1.2.4 实时PCR检测 E-cadherin， N-cadherin，Vimentin mRNA表达水平：按照Trizol试剂盒 （美国Invitrogen公司） 说明书提取细胞总RNA，应用RNA反转录试剂盒 （PrimeScriptTMRT reagent Kit，日本TaKaRa公司）将1 μg总RNA反转录为cDNA，反应体系为20 μL。E-cadherin正义引物序列为5'-TGCCCAGAAAATGA AAAAGG-3'，E-cadherin反义引物序列为5'-GTGTAT GTGGCAATGCGTTC-3'；N-cadherin正义引物序列为5'-GAGAACTTTGCCGTTGAAGC-3'，N-cadherin反义引物序列为5'-GTGTATGTGGCAA TGCGTTC3'；Vimentin正义引物序列为5'-GAGAACTTTGCCGTTG AAGC-3'，Vimentin反义引物序列为5'-GCTTCCTGT AGGTGGCAATC-3'；内参照GAPDH正义引物序列为5'-ACCCAGAAGAC TGTGGATGG-3'，GAPDH反义引物序列为5'-TCTAGACGGCAGGTCAGGTC-3'。应用SYBR® Premix Ex TaqTM（Tli RNaseH Plus） 试剂盒 （日本TaKaRa公司），于Light cycle480实时定量PCR仪对反转录产物进行扩增。结果应用LightCycler480 1.5软件进行分析。

1.2.5 Western blotting 检测 E-cadherin、 N-cadherin、Vimentin蛋白表达水平：将处于对数生长期的TNF-α处理组和对照组细胞按1×l06/孔接种于6孔板，培养36 h后弃掉培养液，用预冷的PBS洗2次，蛋白裂解液冰上裂解细胞30 min，提取蛋白，BCA法蛋白定量。按每孔50 μg蛋白上样，SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳分离，80 mV恒压转膜1～3 h，5%脱脂奶粉封闭l h。加入一抗 （1∶750），4 ℃摇床过夜。漂洗后加入碱磷酸酶标记的二抗 （1∶5 000），孵育1 h。化学发光，显影，压片，灰度扫描。

1.2.6 细胞免疫荧光：在铺有细胞爬片的6孔板中培养细胞，培养液中加入终浓度为20 ng/mL的TNF-α处理36 h，待细胞生长融合至95%～100%时，弃除培养液。4%多聚甲醛冰上固定20 min，0.1%TritonX-100覆盖细胞，室温静置5 min，加入1%牛血清白蛋白稀释的一抗 （E-cadherin 1∶200稀释，N-cadherin 1∶200稀释，Vimentin 1∶50稀释），4 ℃孵育过夜，洗涤，加入PBS稀释荧光二抗 （1∶400），室温避光孵育60 min，DAPI覆盖细胞表面，室温避光静置2 min，封片，4 ℃避光保存备用。

1.3 统计学分析

2 结果

2.1 TNF-α处理后乳头状甲状腺癌TPC-1细胞迁移能力变化

TNF-α （20 ng/mL） 作用36 h后行细胞划痕实验，结果显示，经过24 h爬行，TNF-α处理组TPC-1细胞迁移能力与对照组相比提高了约2倍 （P ＜ 0.01），见图1。

图1 TNF-α对TPC-1细胞迁移能力的影响Fig.1 Effect of TNF-α on migration of TPC-1 cells

2.2 TNF-α处理后乳头状甲状腺癌TPC-1细胞侵袭转移能力的变化

transwell侵袭实验结果显示，TNF-α处理组细胞的侵袭能力较对照组显著提高，差异有统计学意义（P ＜ 0.01）。见图2。

2.3 TNF-α对TPC-1细胞EMT标志物mRNA表达

图2 TNF-α对TPC-1细胞侵袭能力的影响 HE染色×200 Fig.2 Effect of TNF-α on invasion of TPC-1 cells HE×200

水平的影响

实时PCR结果显示，TNF-α处理后，EMT上皮标志物E-cadherin mRNA表达水平较对照组下降（P ＜ 0.01），TNF-α处理12 h时其表达水平约下降至60%～70%；间质标志物N-cadherin和Vimentin mRNA表达水平升高 （P ＜ 0.01），N-cadherin表达最高增加约2倍，而Vimentin表达上调并不明显。见图3。

2.4 TNF-α对TPC-1细胞EMT标志物蛋白表达水平的影响

图3 TNF-α对TPC-1细胞EMT标志物mRNA表达的影响Fig.3 Effect of TNF-α on the mRNA expression of EMT marker in TPC-1 cells

Western blotting结果显示，不同浓度TNF-α作用36 h后，TPC-1细胞中E-cadherin蛋白表达水平下调，N-cadherin蛋白表达水平上调。E-cadherin在TNF-α浓度为10 ng/mL时下调幅度最小，约下调10%，20 ng/mL、40 ng/mL分别下调约55%和59%。不同浓度 （10、20、40 ng/mL） TNF-α作用下，N-cadherin上调幅度依次为

1.24、2.26、1.57倍，Vimentin上调幅度依次为1.02、2.12、1.20倍。如图4所示， 20 ng/mL、 40 ng/mL 浓度 TNF-α处理的细胞与对照组相比，差异有统计学意义 （P ＜0.01）。

2.5 TNF-α处理后TPC-1细胞EMT标志物定位

图4 TNF-α对TPC-1细胞EMT标志物蛋白表达水平的影响Fig.4 Effect of TNF-α on the protein expression of EMT marker in TPC-1 cells

细胞免疫荧光结果显示，浓度20 ng/mL TNF-α处理36 h后，TPC-1细胞中N-cadherin主要定位于细胞膜，而E-cadherin和Vimentin主要定位于细胞质，且E-cadherin表达量减少，N-cadherin和Vimentin表达量增加，与Western blotting结果一致。见图5。

3 讨论

EMT是上皮细胞在某些因素的作用下，失去极性及细胞间紧密连接和黏附连接，获得了浸润性和游走迁移能力，变成具备间质细胞形态和特性的细胞的改变，与肿瘤的转移密切相关。而转移不仅涉及细胞自身的变化，还和肿瘤微环境息息相关。肿瘤细胞和（或）肿瘤相关免疫细胞及炎症细胞都可产生细胞因子，而这些细胞因子可对肿瘤的转移起直接作用［7-8］。细胞因子TNF-α作为一种重要的炎症介质，在炎症、免疫细胞的激活、细胞内稳态、肿瘤进展等方面都发挥着重要作用。临床上，与健康人相比，癌前病变和恶性肿瘤患者通常会出现TNF-α血清浓度和组织表达水平升高［9］。事实上，已有研究发现人类甲状腺组织可表达编码炎症蛋白 的 基 因，如CXCR4，CD44，OPN，CXCL1，CXCL10和SDF-1。甲状腺肿瘤中激活的原癌基因，如RET/PTC，RAS和BRAF，可以启动MAPK级联反应，进而促进细胞自发的促炎症转化。一些细胞因子、趋化因子以及它们的受体表达随之升高，这其中也包括TNF-α［10-11］。通 过SMAD，NF-κB，AKT/GSK-3β，JAK/STAT等信号通路，长期持续的小剂量TNF-α刺激也可诱导其它肿瘤的侵袭和转移［12-13］。

图5 TNF-α处理后EMT标志物蛋白定位情况 细胞免疫荧光染色 ×200

本研究观察了促炎性细胞因子TNF-α对乳头状甲状腺癌TPC-1细胞侵袭转移能力的影响。结果发现，TNF-α不仅增强了TPC-1细胞的迁移和侵袭能力，而且在此过程中出现了EMT的标志性变化，即E-cadherin表达下调，N-cadherin和Vimentin表达上调。未经处理的TPC-1细胞中，E-cadherin呈高表达。LIU等［14］的研究表明，E-cadherin表达于分化良好的甲状腺癌，如乳头状甲状腺癌和滤泡状甲状腺癌中，而在未分化甲状腺癌中则无表达，与本研究结果一致。JENSEN等［15］的研究显示，在TNF-α刺激下，未分化甲状腺癌细胞株WRO中E-cadherin表达下调，而除去TNF-α则使E-cadherin的表达恢复。ROCHA等［16］报道分化良好的甲状腺癌中E-cadherin的下调与不良预后相关。

本研究还观察了另外2个经典的EMT间质标志物N-cadherin和Vimentin的表达情况，二者的mRNA和蛋白表达水平均在TNF-α刺激后呈现一定程度的上调，但Vimentin的上调幅度较小。E-cadherin的缺失和N-cadherin的增加被称为“钙黏蛋白开关”，并在多种实体肿瘤中代表着EMT的发生［17］。Vimentin是EMT的重要调控因子，同时也在乳头状甲状腺腺癌的EMT中发挥关键作用，它可以独立诱导EMT［18］。以上研究结果为Vimentin参与乳头状甲状腺癌的恶性进展提供了直接依据。

综上所述，TNF-α能够在人乳头状甲状腺癌细胞株TPC-1中诱导EMT，并增强人乳头状甲状腺癌的侵袭转移能力。