陈建康，严瑜，潘晓莉，周密，张文泉，杨洁，朱鹏立

（福建省立医院老年科，福建医科大学省立临床医学院，福建省临床老年病研究所，福州 350001）

2型糖尿病病程长，易导致心、脑、肾、血管等器官发生并发症。糖尿病心肌病变是主要并发症之一，以心力衰竭为主要表现，严重可导致患者死亡。糖尿病心肌病变机制尚未明确，目前多认为与氧化应激、炎症反应、细胞死亡、自噬等有关［1］。炎症反应是糖尿病导致心肌病变的重要原因之一，已有研究［1-3］证实炎症反应可以使氧化应激活性氧簇（reactive oxygen species，ROS） 增加，促进粒细胞、单核细胞等炎症细胞的聚集和迁移，增加炎症复合物形成，刺激炎性细胞因子［肿瘤坏死因子-α （tumor necrosis factor-α，TNF-α）、白介素-1β （interleukin-1β，IL-1β） 等］分泌，增加转化生长因子-β1 （transforming growth factor-β1，TGF-β1） 表达，从而导致心肌细胞损伤，进一步造成心肌重塑，形成糖尿病心肌病变。目前，一些研究［2-6］表明通过抑制炎症反应可改善糖尿病心肌病变。

已有研究［7-8］表明膜联蛋白A1是重要的抗炎物质，它通过抑制磷脂酶A2 （phospholipase A2，PLA2）来减少炎症反应复合物形成；抑制炎性细胞因子（TNF-α、IL-1β等） 分泌，改善炎症反应。模拟肽Ac2-26是膜联蛋白A1的小分子片段，由体外获得，具有与膜联蛋白A1相似生物学效应［9］。本课题组前期研究［10］发现膜联蛋白A1改善糖尿病大鼠心功能可能与炎症反应有关。本研究通过体外研究探讨膜联蛋白A1及模拟肽Ac2-26对高糖诱导的大鼠心肌细胞炎症反应的影响。

1.1 材料与方法

1.1 实验动物、仪器及试剂

出生3 d内的清洁级SD大鼠购于福建省医学科学研究院动物中心［动物质量许可证号：SYXK （闽）2017-0011］，雌雄不限。主要仪器和试剂：TP800 型实时荧光定量 PCR 仪 （日本 TaKaRa公司）、超净工作台 （常州普天仪器制造有限公司）、CO2培养箱 （德国科峻公司）、流式细胞仪 （美国贝克曼库尔特有限公司）、DMEM培养基 （美国 Gibco 公司）、总 RNA 抽提试剂盒 （上海飞捷生物技术有限公司）、逆转录试剂盒 （大连宝生物工程有限公司）；兔抗大鼠TNF-α、IL-1β （南京建成生物工程研究所），模拟肽Ac2-26 （美国Santa Cruz公司）。

1.2 方法

1.2.1 心肌细胞制备：取6只大鼠置于超净工作台上，取其心室肌组织，4 ℃D-Hanks液洗净，用细组织剪刀剪碎心室肌组织，0.1%胰蛋白酶消化为单细胞悬液，细胞差速贴壁1.5 h后，用含100 mL/L胎牛血清DMEM 培养液使未贴壁心肌细胞稀释成5×10-5/L，应用0.1 mmol/Brdu 抑制培养基中非心肌细胞增殖，然后将心肌细胞接种在 6 孔板中，每孔为2 mL，置于37 ℃细胞培养箱中继续孵育48 h，换成无血清培养液对心肌细胞进行处理。

1.2.2 实验分组及干预：根据预实验结果，Ac2-26浓度以0.1 mg/mL作为标准剂量干预。将分离的大鼠原代心肌细胞培养 48 h后换液，在倒置显微镜下观察心肌细胞长势，待其细胞长至 90%融合时，将细胞随机分组：正常对照组［葡萄糖 （5.5 mmol/L） DMEM培养基进行培养］、正常干预组［葡萄糖 （5.5 mmol/L）DMEM 培养基、Ac2-26 （0.1 mg/mL） 进行培养］、高糖模型组［葡萄糖 （30 mmol/L ） DMEM 培养基进行培养） ］、高糖治疗组［葡萄糖 （30 mmol/L） DMEM 培养基、Ac2-26 （0.1 mg/mL） 进行培养］。各组细胞均继续培养48 h后收集细胞。

1.2.3 TNF-α、IL-1β检测：收集各组细胞上清液，按照试剂盒步骤采用ELISA法测定TNF-α、IL-1β水平。

1.2.4 实时 PCR检测膜联蛋白A1及PLA2 mRNA表达：原代心肌细胞培养结束后，各培养皿用PBS洗2遍，裂解细胞，提取总RNA及cDNA，按Trizol法提取总RNA，参照说明书对膜联蛋白A1及PLA2进行逆转录和PCR扩增，膜联蛋白A1正反引物序列分别为5'-TCGCAATGAAGGACGATAG-3'和5'-ATATCCTC TTACAGTC-3'，扩 增 长 度 分 别 为307 bp、318 bp，PLA2正反引物序列分别为5'-TCTGTCCAATGACGG AGTC-3'和5'-CTAGTCCAGATTTCTGCCCGTACG-3'，扩增长度分别为296 bp、301 bp，使用1.5%的琼脂糖凝胶电泳检测，凝胶拍照系统自动拍照，最后对图像进行分析。

1.3 统计学分析

2 结果

结果显示，与正常对照组比较，正常干预组膜联蛋白A1、PLA2 mRNA 表达，TNF-α、IL-1β水平下降，但差异无统计学意义 （P ＞ 0.05）。与正常对照组比较，高糖模型组膜联蛋白A1及PLA2 mRNA 表达，TNF-α、IL-1β水平显著上升，差异有统计学意义 （P ＜0.01）。与高糖模型组比较，高糖治疗组PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平明显下降，差异有统计学意义 （P ＜ 0.01）；而膜联蛋白A1 mRNA 表达下降，但差异无统计学意义 （P ＞ 0.05）。见图1，表1、2。

3 讨论

图1 各组膜联蛋白A1及PLA2 mRNA表达Fig.1 Expression of Annexin A1 and PLA2 mRNA in each group

研究［11］显示，糖尿病可以诱发心力衰竭发作或者促进其发展，糖尿病心肌病是非缺血性心肌病的重要病因。既往研究［12］表明糖尿病病程进展中伴随着炎症反应，特别在形成并发症时炎症反应始终参与其中，糖尿病心肌病病变过程中伴随着炎症反应增强。因此通过抑制炎症反应可以改善糖尿病心肌病［2］。

膜联蛋白A1是膜联蛋白超家族中的一员，依赖钙离子与细胞膜磷脂结合，又称为依钙蛋白、磷脂酶A2抑制蛋白，大部分器官、组织均可以表达，在粒细胞/单核细胞中呈更高水平表达。膜联蛋白A1是外周系统重要的抗炎物质，改善机体炎症反应。既往对于膜联蛋白A1研究多集中在感染、肿瘤等方面，近年有些研究［13-16］表明膜联蛋白A1与心脑血管疾病 （动脉粥样硬化、心肌再灌注损伤、冠状动脉粥样硬化性心脏病、脑梗死、机体脏器纤维化等） 也有密切关系。模拟肽Ac2-26是膜联蛋白A1裂解的小分子片段，同样具有强大的抗炎活性，可以改善心肌梗死、抑制小胶质细胞释放炎症介质［17-18］。 PLA2是炎症复合物、炎症介质合成释放的关键酶，在炎症反应过程中发挥重要作用；炎性细胞因子TNF-α、IL-1β主要由单核-巨噬细胞分泌，同样在炎症反应发挥重要作用。本研究采用高糖负荷心肌细胞，模拟糖尿病对心肌病变的影响。结果显示，与正常对照组比较，正常干预组膜联蛋白A1、 PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平没有统计学差异 （均P ＞ 0.05），说明Ac2-26干预效果有限，同样对膜联蛋白A1影响不明显；而在高糖模型组膜联蛋白A1及PLA2 mRNA表 达，TNF-α、IL-1β水 平 都 明 显 上 升 （均P ＜ 0.05），说明糖尿病病程中存在明显炎症反应，膜联蛋白A1抗炎作用明显增加。与高糖组比较，高糖治疗组PLA2 mRNA表达，TNF-α、IL-1β水平明显下降 （均P ＜0.05），提示Ac2-26改善了高糖诱导的心肌细胞的炎症反应，但膜联蛋白A1下降不明显，进一步证实了Ac2-26对膜联蛋白A1影响有限，同时膜联蛋白A1维持较高水平继续发挥抗炎作用。既往研究［14］表明膜联蛋白A1及Ac2-26在体内、体外对缺血再灌注心肌损伤均具有改善作用，本研究证实膜联蛋白A1与高糖诱导心肌细胞的炎症反应关系密切，Ac2-26能够明显减轻炎症反应。推测其机制可能是Ac2-26通过抑制PLA2表达使花生四烯酸、前列腺素、血小板活化因子等炎症活性物质分泌减少，减轻炎症反应，同时抑制PLA2表达后抑制了中性粒细胞表面整合素和脂多糖的表达，使TNF-α、IL-1β分泌减少；另外Ac2-26抑制单核细胞、巨噬细胞等趋化、聚集功能，下调炎性细胞因子TNF-α、IL-1β表达来改善炎症反应。

表1 各组膜联蛋白A1、PLA2 mRNA表达比较Tab.1 Comparison of Annexin A1 and PLA2 expression among the different groups

表2 各组TNF-α、IL-1β水平比较 （ng/L）Tab.2 Comparison of TNF-α and IL-1β level among the different groups （ng/L）

综上所述，膜联蛋白A1与高糖诱导心肌细胞炎症反应明显相关，模拟肽Ac2-26改善了高糖诱导的心肌细胞炎症反应，推测在体内同样可以改善糖尿病大鼠心肌病变，本研究为模拟肽Ac2-26治疗糖尿病心肌病提供了实验依据。