侯胜奎，陶晨雨，胡慧艳，刘 津，李志强，张 婧，贾 青,2,3*

（1.河北农业大学动物科技学院，河北保定 071000；2.国家北方山区农业工程技术研究中心，河北保定 071000；3.河北省山区农业工程技术研究中心，河北保定 071000）

性别预选在动物生产行业中起着重要的经济作用，如奶牛行业更需要母牛，而肉牛行业则需要公牛[1]。精液中X（雌性）或Y（雄性）精子的分离是一种流行的性别选择方法。目前已经开发出几种精子分选技术：基于精子不同免疫学特性进行精子的分选[2-4]，根据X、Y 精子不同的游泳能力进行精子分选[5]，细胞分离液微分离差异[6]和白蛋白梯度的差异分离等[6-7]精子分选技术。采用流式细胞术分离X、Y 精子被认为是最可靠、有效的方法，可获得纯度大于90%的理想性别精子[8-11]。目前检测分选精液纯度的常用方法为流式细胞仪重分析法和多色荧光原位杂交技术，利用流式细胞仪重分析法检测时若物种X、Y 精子DNA 含量低于3%，会影响其检测准确性；多色荧光原位杂交技术复杂，耗时并且需要高技能的技术人员，限制了其应用[12-15]。因此，建立一种快捷、简便、准确性高的性控精液鉴定方法有重要使用价值及广阔的应用前景。

PLP 基因又被称为蛋白质脂蛋白基因，X 染色体特异基因，在胚胎发育早期的胶质祖细胞中表达，并随着胚胎发育成熟而增加[16-20]。Parati 等[21]利用PLP 基因采用探针法对性控精液进行检测，结果符合预期。SRY 为性别决定基因，被Sinclair 等[22]在哺乳动物性腺中发现。Koopman 等[23]将含有SRY 基因的DNA 片段（14 kb）移植到XX 染色体的雌鼠体内，11 只转基因XX 小鼠中有3 只成功实现性反转成为雄性小鼠。本研究对牛X、Y 特有基因PLP、SRY 设计特异引物，构建含有PLP和SRY 基因的质粒，把PLP 和SRY 质粒按照不同比例混合，即X:Y 分别为 1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1，进行实时荧光定量PCR，得到标准曲线，建立检测方法；并对购买的市售性控精液进行实时荧光定量PCR 纯度检测，检测结果与市售性控精液商标标注纯度进行对比，以验证方法的准确性，为今后开展动物性控精液精确检测和性别控制进一步研究奠定基础。

1 材料与方法

1.1 实验材料 中国荷斯坦奶牛血液样品由徐水县漕河镇徐水圣美奶牛专业合作社提供。中国荷斯坦奶牛性控精液购自内蒙古赛科星繁育生物技术有限公司，商业精液来自3 头公牛，牛号分别为15516051、15516055、15517034，每头公牛提供X、Y 性别分选精液和未分选精液各4 支，15516051 号公牛X 分选精液商标纯度为90%，Y 分选精液商标纯度为92%，未分选精液商标纯度为50%；15516055 号公牛X 分选精液商标纯度为90%，Y 分选精液商标纯度为90%，未分选精液商标纯度为50%；15517034 号公牛X 分选精液商标纯度为92%，Y 分选精液商标纯度为90%，未分选精液商标纯度为50%。

1.2 主要试剂 血液、细胞、组织、基因组DNA 提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit（离心柱式）DP304购自天根生化科技（北京）有限公司，Fast Super EvaGreen®qPCR Master Mix 购 自U S EVRBRIGHT®INC，2×Es Taq MasterMix（Dye）、ddH2O、染料（GelStain）、琼脂糖（Agarose）、100 bp DNA Ladder，均购自北京全式金生物技术有限公司。特异引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

1.3 DNA 提取 牛血液DNA 和精液DNA 提取参考血液、细胞、组织、基因组DNA 提取试剂盒TIANamp Genomic DNA Kit（离心柱式）DP304 说明书，将提取的DNA 放-20℃保存备用。

1.4 引物设计与合成 从NCBI 数据库中获取牛PLP 基因和SRY 基因，下载基因序列，利用Primer Premier 5.0设计特异引物，引物序列见表1，引物由北京六合华大基因科技股份有限公司合成。

表1 引物序列

1.5 PCR 扩增 PCR 反应体系总体积50 µL：10×Buffer 5 μL，2.5 mmol/L dNTPs 4 μL，10 μmol/L 上、下游引物各1 μL，Taq 酶0.5 μL，DNA 模板1 μL，ddH2O 37.5 μL。

PLP 基因PCR 反应程序：94℃，5 min；94℃ 30 s，58℃ 30 s，72℃ 13 s，32 个循环；72℃ 10 min；4℃保存。1%凝胶电泳检测扩增条带是否为目的条带。SRY 基因PCR 反应程序：94℃，5 min；94℃ 30 s，62℃ 30 s，72℃ 14 s，32 个循环；72℃ 10 min；4℃保存。1% 凝胶电泳检测所扩增条带是否为目的条带。

1.6 实时荧光定量PCR 反应程序及条件 实时荧光定量PCR 体 系 和 程 序 参 考Fast Super EvaGreen®qPCR Master Mix 试剂盒说明书。反应体系：加入qPCR Mix 10 µL、Sense Primer 10 µmol/L 和Anti-sense Primer 10 µmol/L 均0.8 µL，DNA 样品2 µL，加入ddH2O 补充至20 µL。反应程序：采用三步法，94℃预变性30 s，94℃变性5 s，55℃ 30 s，72℃ 30 s，设置40 个循环。

1.7 质粒提取 取50 μL PCR 产物进行纯化，具体操作步骤参考EasyPure PCR Purification Kit 试剂盒说明书。将纯化产物-20℃保存。要求PCR 产物电泳条带清晰，无杂带，也无引物二聚体。对目的片段连接、转化，进行质粒提取，提取过程按照SanPrep 柱式质粒小量抽提试剂盒说明书进行操作，质粒需-20℃保存。

1.8 标准品质粒拷贝数计算及构建标准曲线 标准品质粒提取后，用NaNoDrop 2000 分光光度计测质粒浓度和质量、A260/280及A260/230，纯度在1.8～2.0，可用于构建标准曲线。质粒拷贝数计算公式：质粒拷贝数（copies/μL）=6.02×1023（copies/mol）×质粒浓度（ng/μL）/质粒分子量（g/mol）。用稀释好的浓度为108拷贝至103拷贝的重组质粒作为模板，每个梯度重复3 次，建立标准曲线，先进行预实验。使用Fast Super EvaGreen®qPCR Master Mix 进行实时荧光定量PCR 扩增（反应条件和程序同上）。

1.9 方法的建立 构建2 个含有扩增PLP 基因片段和SRY 序列的质粒，并将其作为性别相关DNA 定量的参考模板，使用不同比例的PLP 和SRY 质粒，即（X:Y分别为1:20、1:10、1:5、1:1、5:1、10:1、20:1，终浓度为100 fg 作为已知比率模板用来验证市售性控精液的方法。

1.10 市售性控精液的检测 对市售的X、Y 性控精液与未分离精液进行检测（反应条件和程序同上），使用已知DNA 参考模板构建标准曲线，根据Ct 值与每种性别特异性DNA 模板拷贝数之间的关系。使用构建的标准曲线定量市售精液与未分离精液每种性别特异性DNA，每个样品中X 和Y 含量的总和等于100%，用来估计商业精液中X 精子含量（X%）和Y 精子含量（Y%）的百分比。

1.11 统计分析 根据拷贝数和Ct 值关系计算精液的表达量。表达差异采用SPSS19.0 的单因素方差分析，以P＜0.05 表示显著差异，以P＞0.05 表示差异不显著，结果表示为平均值±标准差。

2 结果与分析

2.1 牛PLP 基因和SRY 基因扩增结果 使用母牛DNA样本对牛X 染色体特异性引物进行PCR 扩增，PCR 产物经1%的凝胶电泳检测，扩增目标带大小为214 bp（图1），与预期片段大小一致。使用公牛和母牛DNA 样本同时对牛Y 染色体特异性引物进行PCR 扩增，PCR产物经1%的凝胶电泳检测，扩增目标带大小为229 bp（图2），与预期片段大小一致。

图1 PLP 基因检测结果

图2 SRY 基因检测结果

2.2 标准曲线结果分析 通过对PLP、SRY 基因标准质粒进行扩增，每个质粒模板3 个重复。标准曲线（图3 和图4）显示，起始模板与Ct 呈良好的线性关系，PLP、SRY 基因质粒模板所建立的直线回归的决定系数R2分别达到0.995 9 和0.996 8，表明标准曲线的拟合度极高。

2.3 市售性控精液检测结果 对市售的X、Y 性控精液与未分离精液进行检测，使用参考质粒DNA 构建的标准曲线，根据Ct 值和DNA 模板拷贝数之间的关系，计算出市售的X、Y 性控精液与未分离精液的纯度。如表3 所示，市售精液检测纯度与市售精液商标标注的纯度差异不显著。

图3 PLP 标准曲线图

图4 SRY 标准曲线图

表3 商业精液样品纯度检测

3 讨 论

Rath 等[24]采用流式细胞仪对猪分选精液进行二次分离，获得X 分选精子纯度为97%，为了证实X 分选精液的准确性，对体外受精58 h 的胚胎移植到受体母猪输卵管内，并对其后代进行性别跟踪，结果显示X分选精液后代母猪比例为97%，未分选精液公猪比例为52%，母猪比例为48%。Brien 等[25]对猩猩、狒狒、猕猴3 种动物精液进行流式细胞仪分离，并对分离后的性控精液采用FISH 评价法和流式细胞仪重分析法再次检测精液的纯度，2 种方法所检测的X 分选精液、Y 分选精液、未分离精液差异均不显著。本研究采用实时荧光定量PCR 法对市售牛性控精液纯度值进行检测，被检测的X 分选精液、Y 分选精液、未分选精液3 种精液纯度值与市售精液商标标注纯度值差异不显著；因购买的市售性控精液商标标注纯度值是由流式细胞仪重分析法所得，当动物X、Y 精子之间DNA 含量差异大于3%时，流式细胞仪重分析法比较准确[26-27]，牛X、Y 精子DNA 含量差异为3.8%[28]，由此可见流式细胞仪重分析法所检测的市售性控精液商标标注纯度值比较准确，同时，反映出实时荧光定量PCR 法可用于检测性控精液的纯度，经实时荧光定量PCR 法对性控精液检测，检测结果与市售精液商标标注结果差异不显著，表明实时荧光定量PCR 可用于动物性控精液纯度检测。

实时荧光定量PCR 相对于流式细胞仪重分析法有一定的优势，如某些动物X、Y 精子DNA 含量差异低于3%，流式细胞仪重分析法检测结果准确度比较低，目前，流式细胞仪分析法对牛精液分离效果最好[26-27]。而实时荧光定量PCR 检测方法不会受到X、Y 精子DNA 含量差异的影响，再者，流式细胞仪价格比较昂贵，一般实验室很难配备，实时荧光定量PCR 检测方法相对于流式细胞仪分离检测，适用范围广，准确度有保证，成本便宜[28]。采用实时荧光定量PCR 检测性控精液的纯度有一些注意事项：首先，在构建DNA 参考模板时2 种质粒比例一定要充分混匀，如果DNA 参考模板比例混合不均匀将直接影响样品检测的结果；再者，使用移液枪移取液体时一定要避免枪头内有残留液体，否则会影响结果的准确性；采用实时荧光定量PCR 对性控精液纯度进行检测，该检测法需要特定的仪器，不能直接获得精液纯度，需要间接推测，从而影响了推广应用。实时荧光定量PCR 检测方法要求操作者要有娴熟的操作技巧，并且保证质粒混合均匀，使用精密度比较高的移液枪，从而优化实验结果。虽然实时荧光定量PCR 仍存在不足之处，但这种检测方法为动物性控精液、性别控制等技术研究发展奠定了基础。