唐修阳　王传聪　项杰　欧江涛　王资生

摘要：为了挖掘罗氏沼虾免疫相关单核苷酸多态性（SNP），采用第二代高通量测序技术，对罗氏沼虾的肝胰腺进行转录组深度测序分析。结果发现SNP位点37 589个，其中转换25 188个，颠换12 401个。再对SNP所在的基因进行GO（gene ontology）分类和KOG注释，分别筛选到2 451个有GO注释和2 458个有KOG注释的SNP，并重点对4个重要免疫通路的145个免疫相关基因，筛选出129个SNP位点。相关研究结果将为进一步系统挖掘免疫相关SNP的分子遗传标记奠定基础，为罗氏沼虾疾病防控和选育抗病新品种提供科学参考。

关键词：罗氏沼虾;转录组;SNP;高通量测序技术;免疫;抗病

中图分类号： S942.5  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0145-04

罗氏沼虾（Macrobrachium rosenbergii）又名马来西亚大虾、淡水长臂虾等，广泛分布在江苏、广东和浙江等17个省（市、自治区），年产量超过12万t，是重要的淡水养殖经济虾种之一[1-2]。近年来，由于种质退化、病原滋生等原因，造成罗氏沼虾养殖生产中存在生长缓慢、抗病性减弱以及繁殖力下降等问题，给我国渔业带来严重的经济损失，同时也制约了水产甲壳类动物的可持续发展，相关问题的解决现已提上日程[3-4]。

单核苷酸多态性（single nucleotide polymorphism，简称SNP），通常是指基因组中单个碱基变异所引起的遗传多态性，其变异类型主要包括转换、颠换、缺失和插入。单碱基突变，可导致蛋白发生变异，从而影响生命体有关性状的生物学功能;已有大量研究表明，许多免疫通路中关键基因的SNP是很好的分子免疫遗传标记，在宿主的疾病防控和抗病育种中具有十分重要的意义[5-7]。

通过转录组测序技术，结合物种基因组信息，可以更容易地找到与目标性状相关的SNP。本研究通过对罗氏沼虾肝胰腺转录组的深度测序分析，筛选出大量SNP位点，并对这些SNP所在的基因进行功能注释，重点对重要免疫通路中的关键基因进行了系统的免疫相关SNP的挖掘与筛选。相关结果将为罗氏沼虾的抗病研究提供新的方法与思路，可为下一步抗病分子设计育种提供科学的理论与试验依据。

1 材料与方法

1.1 试验动物与螺原体感染

动物的感染试验于2013年在南京师范大学的江苏省水生甲壳动物病害重点实验室开展，试验动物为100尾罗氏沼虾，个体质量为20～25 g，螺原体检测结果均为阴性，于26～28 ℃水温养殖备用。螺原体在R2液体培养基中于30 ℃孵育48 h，待其生长到对数期备用[8]，将罗氏沼虾均分成2组。对照组注射100 μL无螺原体的R2培养基;试验组注射 100 μL 含螺原体MR-1008的R2培养基。

1.2 罗氏沼虾肝胰腺转录组数据的获得和SNP检测

肝胰腺组织总RNA采用Trizol（Invitrogen公司）提取法提取，提取产物通过Agilent 2100 Bioanalyzer（美国）（D260 nm/D280 nm為1.8～2.2）和15 g/L琼脂糖凝胶电泳进行质检（28S rRNA/18S rRNA>1.0），样品质检合格。用干冰保护并送往杭州联川生物技术股份有限公司，然后按照Illumina公司的测序标准进行测序。由于测序存在一定错误，本研究以测序深度大于100为阈值避免假阳性SNP的产生，使用SOAPsnp软件分析SNP位点信息。

1.3 GO（gene ontology）和KOG功能分析

把SNP所在的基因映射到罗氏沼虾GO注释文件中，并在WEGO（http：//wego.genomics..org.cn/）中对这些基因进行GO功能分类统计。以KOG数据库为参考，对这些基因的功能进行分析。

1.4 挖掘免疫相关SNP

根据测序得到的整个罗氏沼虾肝胰腺转录组中的SNP，结合挖掘到的Toll、IMD、JAK/STST和MAPK 4个免疫通路中的免疫因子，进行免疫相关SNP的挖掘。

2 结果与分析

2.1 样品质量检测

采用Trizol方法提取肝胰腺组织的总RNA，通过琼脂糖凝胶电泳检测，图1显示，5S、18S和28S RNA条带清晰，28S RNA条带亮度是18S RNA条带亮度的2倍关系，紫外分光光度D260 nm/D280 nm测定结果为1.9～2.0，说明RNA提取的质量较好。

2.2 SNP分子标记筛选

通过SOAPsnp软件分析， 发现潜在SNP位点37 589个，其中转换25 188个，颠换12 401个，转换的SNP位点数约占2/3，明显高于颠换。对不同转录本中SNP数量进行统计发现，大部分转录本中的SNP数量少于6个（图2）。

2.3 含SNP位点Unigene（SNP-Unigenes）的功能注释

将得到注释的7 062个Unigenes与GO、KOG数据库中的蛋白序列进行BLAST比对，取阈值e≤10-10，分别筛选到 2 451 个有GO注释和2 458个有KOG注释的SNP标记。

GO是适用于各物种，且不断更新描述和限定基因与蛋白功能的语言词汇标准，SNP-Unigenes的GO分类结果见图3。通过软件对获得GO注释的基因从分子生物学功能（molecular function）、生物学途径（biological process）和细胞组件（cellar component）3方面进行聚类分析。

KOG是真核生物直系同源蛋白簇（clusters of orthologous groups for eukaryotic complete genomes），共分为24类。结果显示，在一般功能预测（general function prediction only，479个），翻译后的修饰、蛋白周转、分子伴侣（posttranslational modification，protein turnover，chaperones，303个）和信号转导机制（signal transduction mechanisms，193个）3个方面聚集的最多，细胞运动（cell motility，3个）最少（表1和图4）。

2.4 免疫相关SNP筛选

对于Toll、IMD、JAK/STST和MAPK 4个主要免疫通路，本研究通过筛选得到145个免疫关键基因，并挖掘到129个SNP位点（表2）。其中4个通路中这145个基因相关免疫SNP数分别为1、10、27、91个。这些SNP位于5′区、CDS区（蛋白质编码区）和3′区的SNP所占比例分别为6.98%、5349%、3953%，位于CDS区的SNP数量超过总数量的1/2。

3 讨论

本研究发现潜在SNP位点37 589个，SNP发生频率是 1 152 bp 中就有1个SNP，与Jung等对罗氏沼虾的表达序列标签（EST）分析得出的945 bp 1个SNP[9]和人基因组中1 kb 1个SNP[10]大致同等水平，较低于中华绒螯蟹的189 bp 1个SNP[11]和大西洋鲑的641 bp 1个SNP[12]。这些SNP的发现丰富了水产甲壳动物的分子标记的数据，为促进分子标记挖掘和育种提供了分子材料。尤其是针对4个免疫通路145个免疫关键基因中挖掘到129个SNP位点， 经过后续的试验验证和实践应用，这些免疫候选标记将可能为虾类培育出具有强抗病性的新品种。

参考文献：

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