陈凌云　余芳洁　陈君杰　朱祝军　王华森　郁有健

摘要：硫代葡萄糖苷（简称硫苷）是十字花科植物中富含氮、硫的次生代谢产物，在植物防御和人类营养健康方面具有重要作用。源于硫苷可变氨基酸侧链的不同修饰，赋予了硫苷结构的多样性及其代谢产物的特殊活性。归纳和总结了近年来脂肪族、吲哚族和芳香族硫苷的二次修饰、转录因子和几种关键植物激素对硫苷二次修饰的调控作用以及硫苷二次修饰相关基因对硫苷合成反馈调节的研究进展。这对于深入认识硫苷合成和调控的分子机理以及十字花科蔬菜作物的抗性和高品质育种具有重要意义。

关键词：硫代葡萄糖苷;二次修饰;转录因子;调控;多样性;研究进展

中图分类号： S184  文献标志码： A  文章编号：1002-1302（2019）04-0022-07

硫代葡萄糖苷（glucosinolates，GSLs）简称硫苷，是富含氮、硫的植物次生代谢产物，主要存在于十字花科植物中，它的降解产物在植物的防御性反应中起重要作用[1-2]，同时这些代谢产物也与人类的营养和健康息息相关[3]。截至2011年，在自然界植物中发现的硫苷已达132种[4]。硫苷种类丰富，结构多样，但都具有相同的基本结构，包括含糖基团、硫酸盐基团和可变的非糖侧链（R）3个部分。根据R的不同，可将硫苷分成脂肪族、吲哚族和芳香族三大类。硫苷的合成可分为氨基酸侧链的延伸、核心结构的形成和侧链的二次修饰这3个步骤[5]。

侧链的二次修饰是不同硫苷合成的最后一步，不同修饰路径能够得到具有特殊活性的硫苷，在很大程度上促成了硫苷种类的多样性[6-7]，因此侧链的二次修饰在硫苷合成的整个路径中具有突出的意义。例如，脂肪族硫苷降解得到的异硫氰酸盐可以抵抗核盘菌，它的毒性取决于其侧链的结构[1];甲基亚磺酰烷硫苷侧链上的硫原子经过氧化之后其降解产物才具有抗癌活性，并且抗癌活性根据其侧链长度不同而存在差异[8]。因此，明确硫苷侧链二次修饰过程中相关基因的功能，解析各种硫苷形成相关关键基因的调控机理，对于培育抗性强、品质好的十字花科蔬菜等农作物有重要的意义。

本文从脂肪族、吲哚族和芳香族硫苷的二次修饰、转录因子和几种关键植物激素对硫苷二次修饰的调控作用以及硫苷二次修饰相关基因对硫苷合成的反馈调节几个方面，对硫苷二次修饰相关基因及其调控的最新研究进展进行了归纳和总结，对于深入认识硫苷合成和调控的分子机理及十字花科蔬菜作物的抗性和高品质育种具有重要意义。

1 脂肪族硫苷二次修饰的研究进展

脂肪族硫苷是植物硫苷中最大的家族，种类也最为丰富。脂肪族硫苷核心结构合成之后，主要经过氧化、烯基化、羟基化、苯甲酰化和芥子酰化的修饰后形成生物活性多样的硫苷。

1.1 脂肪族硫苷侧链的氧化修饰

脂肪族硫苷核心结构形成之后得到甲基硫烷硫苷（methylthioalkyl GSLs，MtGSLs），其侧链上的硫原子经黄素单氧化酶氧化修饰之后生成甲基亚磺酰烷硫苷（methylsulfinylalkyl GSLs，MsGSLs）（图1中的b1～b2）。值得注意的是MsGSLs侧链的碳原子为3～8个，其中侧链碳原子数为4、7、8的MsGSLs的降解产物具有很强的抗癌活性[8]。目前，在拟南芥中共鉴定了7个黄素单氧化酶基因[AtFMOGS-OX（1-7）][9-10]（表1），AtFMOGS-OX（1-4）主要在叶脉、主根和侧根等局部中表达，AtFMOGS-OX5则在主脉、各个分支叶脉及根的全部维管组织中表达，AtFMOGS-OX6和AtFMOGS-OX7主要在幼苗时期的维管束细胞、成熟植株的叶片、花萼、心皮和雄蕊花丝中表达。除了AtFMOGS-OX4，其余6个基因都能够催化硫苷侧链上的硫原子氧化，其中AtFMOGS-OX5能够特异性识别长链底物[10-12]。此外，最新研究表明，拟南芥中参与黄酮类O-甲基化的重要酶O-甲基转移酶1（AtOMT1）（表1）可能通过一种与FMOGS-OX1相互作用的方式，也参与了甲基亚磺酰硫苷形成相关的氧化修饰作用[13]，但在该修饰作用中的具体功能和作用方式还须要进一步的研究去证明。

1.2 脂肪族硫苷侧链的烯基化、羟基化修饰

脂肪族硫苷侧链上的硫原子被氧化后，依次再经过烯基化和羟基化两步修饰，或是直接羟基化修饰形成羟基化硫苷（OH-GSLs）。研究表明，2个编码2酮-戊二酸的双加氧酶的基因AOP2和AOP3（表1）对于脂肪族硫苷侧链的烯基化、羟基化修饰具有重要作用，其中AOP2能够催化MtGSLs形成链烯基硫苷，而AOP3能够催化MtGSLs形成羟烷基硫苷（图1中的b2～b3）[14]。值得注意的是，4-甲基亚磺酰丁基硫苷（4MSOB）的降解产物被证明具有很好的抗癌活性，因此目前受到更多研究人员的关注[15]。在芸薹属（Brassica）蔬菜作物中，白菜、甘蓝和芥蓝都含有具有功能的AOP2基因，所以它们的4MSOB多数进一步被烯基化，因此含量很低。

西兰花是甘蓝一个缺失功能性AOP2基因的变种，其4MSOB不能够进一步被烯基化，故4MSOB的含量相对较丰富，同时采用反义RNA的方法抑制芥蓝中AOP2基因的表达，能够显著提高转基因芥蓝株系中4MSOB的含量[16]。链烯基硫苷在GS-OH[现证明是一种Fe（Ⅱ）依赖的加氧酶超家族蛋白At2g25450，表1]的进一步作用下[17]，能够进一步被修饰成羟基-烯基硫苷[18]（图1中的b4～b5），这类羟基化的硫苷因其降解产物唑烷-2-硫酮会引起家畜的甲状腺肿大，从而使油菜等芸薹属作物的应用价值大大降低[17]。

1.3 脂肪族硫苷側链的芥子酰化和苯甲酰化修饰

目前研究表明，羟基化的脂肪族硫苷3-羟基丙基硫苷（3OHP）和4-羟基丁基硫苷（4OHB），能够进一步通过苯甲酰化形成3-苯甲酰氧基丙基硫苷（3BZO）和4-苯甲酰氧基丁基硫苷（4BZO），或是芥子酰化修饰后形成3-芥子酰基氧基丙基硫苷（3SIN）和4-芥子酰基氧基丁基硫苷（4SIN）（图1）[19]。苯甲酰基是硫苷苯甲酰化修饰所必需的，它是由苯丙氨酸在肉桂酰辅酶A参与下，以β-氧化或非氧化的方式缩短侧链后生成的苯甲酸再经一系列的反应形成的。研究表明，肉桂酰辅酶A连接酶（BZO1）（表1）能够催化肉桂酸和辅酶A形成肉桂酰辅酶A[19]，进一步代谢生成苯甲酰葡萄糖而参与苯甲酰化硫苷的合成[19-20]（图1）。Lee等研究发现，拟南芥中丝氨酸羧肽酶类（SCPL）基因AtSCPL19可以催化苯甲酰葡萄糖形成苯甲酰胆碱，从而间接影响苯甲酰化硫苷合成（图1）;AtSCPL17很可能也是与苯甲酰化修饰直接相关的基因，但它是不是硫苷苯甲酰化修饰最后一步的修饰基因，目前仍没有确切的试验证据（图1中的b3～b8、b3～b6）[20]（表1）。值得注意的是，虽然已经证明BzGSLs和SnGSLs被修饰之前的硫苷降解产物在抗癌和抗病原菌方面有着重要的应用价值。但是它们的降解产物及其本身到底有怎样的生物活性，目前尚没有明确的报道，有待进一步深入研究。

脂肪族硫苷二次修饰分别涉及多个与氧化、烯基化、羟基化、苯甲酰化和芥子酰化相关的基因，它们的多态性和多样性是导致脂肪族硫苷种类多变和功能差异的主要原因之一[21]。此外，是否还有其他基团能与羟基发生酰化反应，从而使脂肪族硫苷的种类和功能具有更多的可能性，这些也须进一步研究和关注。

2 吲哚族硫苷二次修饰的研究进展

侧链源于色氨酸的硫苷称为吲哚族硫苷，其代谢产物涉及植物生长发育的多个方面，并且有助于防御烟蚜等害虫的侵害和提高植物先天的免疫能力[22-23]。目前研究表明，吲哚族硫苷的二次修饰主要包括氧化、羟基化和甲氧基化。在吲哚族硫苷修饰过程中，细胞色素P450蛋白家族的CYP81F（1-4）（表1）能够催化吲哚-3-甲基硫苷（I3M）形成4-羟基-吲哚-3-甲基硫苷（4OH-I3M）或1-羟基-吲哚-3-甲基硫苷（1OH-I3M），再经过O-甲基转移酶IGMT1和IGMT2（表1）催化作用， 分别形成1-甲氧基吲哚-3-甲基

硫苷（1MO-I3M）和4-甲氧基吲哚-3-甲基硫苷（4MO-I3M）[24-25]（图1中的a2～a4、a3～a5）。

研究表明，AtCYP81F（1-4）均能催化I3M形成OH-I3M（图1中的a1～a2）。CYP81F1、CYP81F2和CYP81F3主要催化I3M生成4OH-I3M，其中CYP81F2起着更加主效的作用。在缺失AtCYP81F2的拟南芥突变体中只能检测到少量的4OH-I3M和4MO-I3M，且温和的渗透胁迫诱导的 4MO-I3M的积累显著降低，表明AtCYP81F2是4MO-I3M合成的关键基因[24，26]。CYP81F4主要催化1OH-I3M的生成。在白菜中，存在2个AtCYP81F4的直系同源基因BrCYP81F4-1和BrCYP81F4-2，它们是白菜中1MO-I3M合成的关键基因，其中BrCYP81F4-2在白菜叶中的相对表达量最高，而BrCYP81F4-1主要在根中表达[27]。在拟南芥AtCYP81F4的缺失突变体中分别过表达这2个基因表明，植株中1MO-I3M都有较高的积累，而过表达BrCYP81F4-2植株中的1MO-I3M积累更高，说明BrCYP81F4-2的催化效率更高[27]。此外，不同植物中CYP81F家族的基因还可能存在器官或组织的特异性，有些成员还会产生亚功能化或新功能化[24，28]。同样，在拟南芥中的研究也表明，2个O-甲基转移酶AtIGMT1和AtIGMT2也存在一定的功能冗余[24-25]

关于拟南芥吲哚族硫苷合成的关键催化酶cyp79B2B3双突变体的膜蛋白组学的最新研究表明，拟南芥中参与黄酮类O-甲基化的重要酶AtOMT1（表1）除了参与脂肪族硫苷的二次修饰外，它还可能以一种类似于将甲基槲皮素转变为异鼠李素的甲基化作用方式在羟基吲哚族硫苷的甲基化过程中起重要作用[13]。此外，细胞色素P450蛋白家族的AtCYP71B26和主要参与脂肪酸代谢氧化还原反应的AtCYP86A7（表1），可能通过与AtCYP81F2直接或间接作用的方式影响4OH-I3M的合成，并且也可能是参与修饰产生1OH-I3M的关键酶[13，29]。到目前为止，有关AtOMT1、AtCYP86A7和AtCYP71B26在催化生成4OH-I3M和1OH-I3M的过程中所具有的确切生物学功能，还需要更多的试验去鉴定。

植物吲哚族硫苷能迅速响应环境的变化，例如在有害虫胁迫时，超過90%的吲哚族硫苷含量增幅可以达到1.2～20倍[30]。不同的植物逆境还能够显著影响吲哚族硫苷的组分、结构及其二次修饰相关基因的表达量，因此未来同样须对吲哚族硫苷的二次修饰进行深入的研究和探索。

3 芳香族族硫苷二次修饰的研究进展

R基具有芳香基团的硫苷称为芳香族硫苷，分为侧链源于络氨酸的苯乙基硫苷和苯丙氨酸的苄基硫苷[31]，前者属于链延长，后者属于非链延长，它们在植物抗病虫害和消除炎症方面都有独特的作用[32]。目前，在十字花科植物中检测到的芳香族硫苷有2-苯乙基硫苷、（2R）-2-羟基-2-苯乙基硫苷、（2S）-2-羟基-2-苯乙基硫苷、（3R）-2-羟基-2-（4-羟基苯基）乙基硫苷、4-甲氧基苯乙基硫苷、（R）-2-（4-甲氧基苯基）-乙基硫苷、4-羟基苯硫苷和苄基硫苷、4-羟基苄基硫苷、4-羟基-3，5-二甲氧基苄基硫苷、3，4-二甲氧基苄基硫苷、3，4，5-三甲氧基苄基硫苷、3-羟基苄基硫苷、3-甲氧基苄基硫苷、4-羟基-3-甲氧基苄基硫苷[33-35]。因此，芳香族硫苷侧链目前能检测到的二次修饰主要是羟基化，可能还存在甲基化和甲氧基化（图2）。在G型（抗小菜蛾）和P型（不抗小菜蛾）的欧洲山芥中，unigene：CL12207.Contig1All（S-羟基化酶，SHO）和T-Unigene.BMK. 14596（R-羟基化酶，RHO）（表1）是拟南芥中编码烯烃基脂肪族硫苷羟基化的重要修饰酶At2g25450的同源基因，它们分别能够催化2-苯乙基硫苷产生2-羟基-2-苯乙基硫苷的异构体[36]。另外1种目前未知的para-羟基化酶（PHO）（表1）则能够继续催化（2R）-2-羟基-2-苯乙基硫苷羟基化形成（3R）-2-羟基-2-（4-羟基苯基）乙基硫苷，该硫苷的降解产物为具有很好的杀虫和抗菌效果的2-噻唑烷酮，不同于它的前体硫苷降解所产生的唑-2-硫酮，且该基因的活性受到植株生长环境变化的调控，但虫吃处理不能诱导它表达量的升高和修饰产物的含量增加[34，36]。与芳香族硫苷羟基化修饰相关基因的研究相比，其甲基化和甲氧基化修饰相关的基因尚没有相关的报道。目前，虽然对于十字花科植物中芳香族硫苷种类及其功能的报道不断增加，但是关于芳香族硫苷的二次修饰相关基因的研究和报道仍然很少，须进一步加深对这一领域的研究，从分子水平上对芳香族硫苷苯基及其衍生物的合成进行解析，以进一步揭示它们在提高植物抗性过程中的作用。

4 转录因子对硫苷二次修饰的调控研究进展

在植物发育的不同阶段，硫苷的合成和降解及其在不同器官和组织之间的积累和分布都会受到各类转录因子的调控。MYB是植物最大的转录因子家族之一，参与调控植物新陈代谢和生长发育的多个方面，其中一个亚类的成员能在转录水平上调节硫苷修饰相关基因的表达。拟南芥中的硫苷合成的调控相关研究表明，AtMYB28、AtMYB29、AtMYB76、AtMYB115和AtMYB118能够调控脂肪族硫苷的合成[37-38]，AtMYB34、AtMYB51和AtMYB122可以调节吲哚族硫苷的合成[39-40]，AtMYB115和AtMYB118可以调控苯甲酰氧基硫苷的代谢（表2）。在myb118拟南芥突变体中，硫苷修饰相关的基因AtAOP3、AtBZO1、AtSCPL17和AtFMOGS-OX2的表达量均显著上升。在myb34myb51myb122拟南芥突变中，4MO-I3M的重要修饰基因AtCYP81F2的表达量上升了10倍[39]。在myb28myb29双突变体中，脂肪族硫苷修饰的关键基因FMOGS-OX1和FMOGS-OX3的含量不足野生型的1%[38]（表3）。在结球甘蓝中，MYB28有4个拷贝分别是（Bol017019、Bol036743、Bol007795、Bol036286），FMOGS-OX5则有2个拷贝分别是（Bol031350和Bol029100），其中MYB28（Bol017019，Bol036743）与FMOGS-OX5（Bol031350）具有高度的正相关性[41]。除了MYB家族外，bHLH转录因子家族的AtMYC2、AtMYC3和AtMYC4的3个成员（表2）同样能在转录水平上调节硫苷二次修饰的相关基因（表3）。研究发现，在拟南芥myc2myc3myc4突变体中，脂肪族硫苷侧链二次修饰相关的基因AtFMOGS-OX3、AtFMOGS-OX1和AtAOP2的表达量降低极其显著（表3）。AtMYC2、AtMYC3和AtMYC4这些转录因子还可能是硫苷二次修饰的复杂调控过程中的重要辅助因子，可以使植株更加精细和有效地调控硫苷合成和修饰[42]。不同的转录因子对于硫苷二次修饰的调节正在由单线模式向模块化系统转变，随着新bHLH转录因子家族的成员不断被发现和鉴定[43]，它们对硫苷二次修饰相关基因的调控作用也将不断被揭示。同时对bHLH、MYB和MYC家族成员之间相互影响的研究[44]，也将能够更加详细地阐明它们在硫苷二次修饰途径中的复杂和多维的调控作用。

5 植物激素对硫苷二次修饰调控作用的研究进展

脱落酸（ABA）、乙烯（ET）、茉莉酸甲酯（MeJA）、水杨酸（SA）和生长素（IAA）是常见的植物激素，它们在植物的生长发育过程中具有重要的调控作用，研究表明它们对于硫苷的二次修饰也均具有重要的调控作用（表4）。

几乎所有的硫苷二次修饰相关的一系列基因在ABA和ET处理后表达均上调，但是不同的基因上调的幅度不同[10]。在植株被真菌病原体感染时，ABA可以激活MPK3和短暂激活MPK4和MPK6，从而MPK3和MPK6可以进一步激活ERF6的表达，ERF6能够促进吲哚族硫苷修饰的关键基因CYP81F2、IGMT1和IGMT2的表达，从而催化I3M转化为4MO-I3M，以抵抗真菌病原体侵染[45-47]。此外，ABA处理还可以使脂肪族硫苷修饰的关键基因FMOGS-OX1、FMOGS-OX2和FMOGS-OX6的表达量上升5倍[10]。乙烯利（ACC）处理能显著增加脂肪族硫苷修饰关键基因FMOGS-OX5、FMOGS-OX6和FMOGS-OX7的表达量，ET还可以提高脂肪族硫苷的含量并且抑制由植食性昆蟲诱导产生的吲哚族硫苷的合成[48]。JA处理能够显著提高甘蓝中BoAOP2的表达量，在拟南芥中MeJA能够明显促进AtAOP2和AtFMOGS-OX1的表达，使吲哚基-3-甲基硫苷含量增加3倍，1-甲氧吲哚基-3-甲基硫苷增加7倍[10，49]。SA可以促进植株中4MSOB和8-甲基亚磺酰辛基硫苷（8MSOO）的积累，其中短链脂肪族硫苷（4MSOB除外）所占比例先降低后升高，长链脂肪族和4MSOB则先升高后降低[50]。IAA能够明显提升脂肪族硫苷修饰关键基因FMOGS-OX2和FMOGS-OX5的表达量[10]。虽然，目前的研究表明这些植物激素的单一处理对硫苷的二次修饰均存在一定的调控作用，但这些相关激素对植物代谢具有多维度的拓扑结构式的复杂网络调控作用[51]，它们在调控过程中也可能存在一定的相互协同或拮抗作用[52]。进一步深入探索这些激素对于硫苷二次修饰的调控机制，将能够为通过化学方法人为调控十字花科蔬菜作物中硫苷的组分和含量奠定基础。

6 硫苷二次修饰相关基因的反馈调节

在植物次级代谢产物的代谢调控中，反馈调节是一个关键组成部分[53]。反馈调节是代谢反应产物对关键酶的影响，这对整个代谢反应中相关联反应的精准调控是十分重要的[54]。

AOP2是脂肪族硫苷侧链二次修饰中的关键基因，拟南芥中AtAOP2可能通过正反馈作用调控相关MYB转录因子，从而使烯烃基硫苷成为含量最高的脂肪族硫苷[55-56]。在拟南芥Col-0生态型（缺失AtAOP2基因）中，含量最少的脂肪族硫苷是甲基亚磺酰烷硫苷，过表达甘蓝BoAOP2基因发现，该脂肪族硫苷的关键修饰基因能够通过调节AtMYB28的表达来增加脂肪族硫苷含量，同时它还可以上调AtMYC2、AtLOX3、AtLOX4和AtAOC1等12个JA合成关键基因的表达量[57]。外源性烯丙基硫苷处理，能够使拟南芥Col-0植株中的8-甲硫辛基硫苷（8MTO）等一系列脂肪族硫苷的含量都有所下降，但在导入AOP2基因后，该修饰关键基因能够通过反馈调节，使植株内的这些脂肪族硫苷的含量大幅增加[58]。此外，在拟南芥myb28myb29双突变体中，脂肪族硫苷含量几乎为0，AtAOP2仍可以调节植株对JA的敏感性和硫苷合成相关基因的表达，并且它的调节不依靠已知的它所具有的催化功能[57]。因此，AOP2的RNA或蛋白可能还有未被鉴定的调节功能，进一步研究硫苷二次修饰关键基因AOP2的反馈调节作用机理，对于深入理解硫苷的合成与调控具有重要意义。

7 展望

近年來，随着植物中发现的硫苷种类不断增加，硫苷二次修饰相关基因的生物学功能以及相关代谢调控网络途径的相关研究也逐渐展开。通过对拟南芥硫苷二次修饰的代谢和调控关键基因的缺失突变或过表达相关基因的研究，能够为在其他物种中开展这些基因功能的研究奠定基础。须要对硫苷二次修饰过程中的目标代谢和调控基因进一步进行敲除或过表达相关研究，以进行相关代谢工程方面的研究与实践和创造具有更高应用价值的代谢产物，对于进一步改善人们健康状况和生活质量具有重要意义。同时，在植物育种过程中，这些硫苷修饰及其调控关键基因的突变体和转基因株系能为新品种的选育提供重要参考数据，对于十字花科蔬菜作物的品质改良和抗性提高具有重要理论和实践意义。

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