邓 萍 蒋启华 孙立力 蒋君好

1.重庆医科大学药学院 重庆 400016

2.重庆医科大学药学实验教学中心 重庆 400016

药物与靶点分子之间的相互作用对于基于结构的药物设计和药物分子改造具有重要意义。随着晶体衍射和核磁共振技术的不断进步，大量的药物分子与靶蛋白复合物的晶体结构得到解析。从复合物晶体结构中可以较为准确地分析药物分子结构中对活性贡献较大的基团及其空间分布特征。因此，在基于活性配体和受体晶体结构构建的药效团模型具有较高的准确性，也是目前新药研发中进行反向找靶和虚拟筛选的常用手段。

随着计算软件和硬件的快速发展，计算机辅助药物设计已经成为药学研究的重要手段之一，且必将起到更加重要的作用。药学专业药物化学教材中对分子对接、药效团模型等计算机辅助设计内容进行了简单的介绍[1]。由于篇幅限制，介绍内容较浅，学生对药效团概念的认识不够。药效团模型已经成为新药研发的重要辅助手段，掌握药效团相关概念对于药学专业学生毕业后从事新药研发工作具有一定的价值。因此，结合科研工作实践，将科研项目内容进行简化，并应用于本科生创新实验项目；让部分学有余力的本科生通过参与创新实验项目，掌握药效团模型构建的基本流程和相关概念，为今后从事药物设计工作奠定基础。

1 实验项目的选题背景

1.1 科研成果转化为教学内容

TGFβR1抑制剂作为治疗恶性肿瘤的新型药物受到广泛关注。项目组基于TGFβR1-BMS22受体配体复合物晶体结构构建了含有2个氢键受体、4个疏水特征的药效团模型。基于构建的药效团模型对数据库进行虚拟筛选寻找到了具有潜在活性的2个新型骨架结构；在此基础上，进行结构修饰和改造设计了新的TGFβR1拮抗剂。所设计的化合物，结构新颖、类药性较好，具有潜在活性；且相对于化合物BMS22可能具有更高的安全性，具有进一步研究的价值[2]。基于上述科研成果，对相关实验内容进行了简化；针对本科生的知识结构背景，去掉数据库虚拟筛选等部分难度过高的内容，将其中的药效团模型构建筛选出来作为本科生创新实验项目。本实验可作为药学生的创新实验项目，用于开展大学生科技创新活动；也可作为药物设计相关课程的上机实验。通过参与本实验，让学生掌握了药效团构建和验证的相关操作流程及掌握药效团的基本概念，熟悉药物和靶蛋白的作用机制等。

1.2 科研平台面向本科生开放

Discovery Studio软件(以下简称DS)是常用的分子建模和模拟软件之一，也是计算机辅助药物设计平台常用的计算模拟软件。它被广泛于药物设计与优化、蛋白质结构与功能研究中。DS软件的基于受体—配体晶体复合物构建药效团模块能较为准确地产生药效团模型，比其他药物设计软件具有更加友好的操作界面，易学易懂，更便于操作。

DS软件是计算机辅助药物设计科研平台的常用软件。科研平台面向本科生开放，科研软件用于科研工作的同时，也服务于本科教学工作，能最大程度地发挥软件的价值和功能。本科生早期接触科研工作，也更利于培养学生的创新思维和创新能力。

2 实验内容的设计及实验步骤

2.1 受体配体复合物晶体结构的载入和预处理

TGFβR1的蛋白质晶体结构于1999年被首次报道(PDB ID：1B6C)。截至目前，PDB数据库(http://www.rcsb.org)已收载了多个小分子抑制剂和TGFβR1复合物的晶体结构，包括1PY5，1VJY，2WOT，2X7O、3FAA，3GXL，3KCF，3TZM，6B8Y等。百时美施贵宝公司研发的BMS22是目前报道的具有高选择性和高活性的TGFβR1抑制剂。受体/配体复合物的晶体结构(PDB ID：6B8Y)很好地诠释了拮抗剂和受体之间的作用位点和作用方式。从PDB数据库下载所需的受体配体复合物晶体结构；结构下载后，通过补充氨基酸残基、蛋白加氢等对复合物进行处理后，用于药效团模型构建。

复合物结构载入的步骤为：File→Open URL→ID:6B8Y。

蛋白文件处理：在左侧窗口中删除water和ligand groups中除BMS22的其他配体，依次点击Tools→Macromolecules→prepare protein→clean protein，补充非完整的氨基酸残基，为蛋白加氢等。

通过本实验步骤掌握的知识点包括晶体结构查询和下载方法、靶蛋白的预处理。

2.2 测试集数据的准备

准确预测测试集数据的能力是药效团模型可靠的重要属性。测试集包括活性分子和非活性分子；通过用已知的活性化合物与非活性化合物验证模型区分能力。根据文献报道的活性数据，筛选了87个具有较高活性的化合物作为活性分子，用于验证模型的敏感度(Sensitivity，SE)。SE定义为：TP(True Positives)/TP+FN(False Negatives)。非活性分子从DUD-E数据库(http://dude.docking.org/)下载。DUD-E数据库包括了102个药物作用靶标[3]；DUD-E中提供TGFβR1靶标的8 677个非活性分子验证模型的特异性(Specificity，SP)。SP定义为：TN(True Negative)/TN+FP(False Positives)。两个数值分别表示模型对活性分子以及非活性分子的识别能力；数值越接近1，识别能力越强。

通过本实验步骤掌握的知识点包括活性分子和非活性分子的筛选、药效团模型测试等。

2.3 药效团的构建

应用DS软件的Receptor-Ligand Pharmacophore Generation模块，以缺省参数完成模型构建。根据模型打分值和模型对测试集分子的敏感性和特异性，结合ROC曲线，综合考虑，筛选最佳药效团模型。

操作步骤如下：(1)工具浏览器 (Tools Explorer)中 ，展开 Pharmacophores | Create Pharmacophores Automatically，单击Receptor-Ligand Pharmacophore Generation。(2)流程对应参数设置。Input Receptor为处理好的蛋白结构的名称；Input Ligand为BMS22分子结构的名称。Validation设为True，展开设置Active Ligands为已构建的活性分子数据名称；Inactive Ligands为所构建的非活性分子数据名称。其余参数采用默认设置，点击Run运行作业。

通过本实验步骤掌握的知识点，为DS软件中基于受体配体复合物的药效团构建流程。

2.4 药效团模型的筛选和分析

构建得到了10个药效团模型。点击report查看计算结果。从Summary一栏可知，此次运算共产生了10 个药效团模型。模型的相关特征如表1、表2及图1所示。

表1 构建得到的药效团模型特征参数和打分值

表2 药效团模型对活性化合物及非活性化合物的命中结果

图1 药效团模型ROC曲线图(模型02)

综合考虑模型打分值、SE值和SP值，并结合 ROC曲线下面积，选择模型02作为最终模型。该药效团模型特征为AAHHHH，含有2个氢键受体(HBA)、4个疏水特征(HYD)。药效团模型对训练集化合物具有较高的敏感性(SE=0.81176)和特异性(PE=0.78754)。ROC曲线的曲线下面积以Quality值表征，该值为0.879。

根据药效团02和BMS22的叠合图分析(如图2所示)，BMS22分子吡啶环上-CF3的疏水特征，3个环平面形成的疏水特征和环上两个N原子作为氢键受体特征，是BMS22分子的重要的药效特征，可以根据上述药效特征进行分子改造和设计。

图2 药效团模型02和BMS22的叠合的示意图

通过本实验步骤主要掌握的知识点为药效团模型的筛选和药效团特征分析方法。

3 结语

第一，化学计算软件被广泛地应用于药学科学研究和本科生教学中[4,5]。本文基于科研成果，设计了药效团模型构建实验，应用于本科生创新实验项目中，能帮助提升药学学生的创新能力。

第二，本实验项目具有很好的扩展性，可以根据学生的知识能力情况，对实验内容进行扩展和衍生。如，活性分子和非活性分子数据库的建立可以作为扩展内容，由学生进行文献检索和资料收集。药效团模式构建后可以进一步应用于数据库虚拟筛选、反向找靶等后续研究内容。

第三，随着化学计算软件的不断优化和计算机硬件技术的飞速发展，化学计算软件必将更多地应用在药物性质研究和新药设计中。DS软件引入药学本科生创新实验项目中，通过实验研究，不但可以形象展示受体蛋白的空间结构、受体配体作用方式、受体配体表面等特征，提升教学效果；同时让学生了解计算机辅助药物设计的新技术，为后期开展新药设计等相关研究打下基础。

第四，很多药物设计软件是基于Linux系统开发的，系统操作并不友好，限制了其在本科教学中的应用。尽管DS软件作为商业软件，购置成本较高；但其具有操作界面友好、Windows版本便于学习、易于上手等特点，非常适合本科教学。

将科研成果和科研软件应用于本科教学工作。基于DS软件为本科生设计开发了基于受体配体复合物结构的TGFβR1抑制剂药效团模型构建实验，本实验包含了靶点蛋白处理、测试集分子准备、药效团构建和结果分析等实验内容。本科生通过实验可以完整的了解药效团构建和验证流程，熟悉计算机辅助药物设计研究的相关方法，并深刻认识药效团的相关概念，培养学生的创新意识和创新能力。