许小洁　于伟鹏　杨广玲　韩士玲　何梦君　杨旭　李向东

摘要：利用RT- PCR克隆甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic virus，SCMV） DWKI分离物辅助成分一蛋白酶（ helper component - proteinase，HC - Pro）基因，酶切后连接原核表达载体pEHISTEV，得到重组质粒pE-HISTEV - SCMV - HC - Pro。将重组质粒转化大肠杆菌菌株Rosetta，经IPTG诱导后，表达出57 kD的融合蛋白。切胶回收融合蛋白，多点注射法免疫新西兰长耳兔，制备SCMV HC - Pro抗血清。间接ELISA结果表明，该血清效价为1：8 192。感染DWKI的玉米叶片病汁液稀释128倍时，该血清仍然能够有效检测出HC - Pro。Westem - blot检测结果表明，该血清可特异性检测SCMV第1组分离物DWKI和第Ⅳ组分离物DWK2，与同属的烟草脉带花叶病毒（ TVBMV）和马铃薯Y病毒（PVY）均无反应。本研究为准确、快速检测SCMV HC -Pro并进一步研究其功能和作用机制奠定了基础。

关键词：甘蔗花叶病毒;辅助成分一蛋白酶;原核表达;抗血清;检测

Prokaryotic Expression and Antiserum Preparation of HelperComponent - Proteinase of Sugarcane mosaic virusXu Xiaojie1，2 ， Yu Weipengl，2* ， Yang Guanglingl ， Han Shilingl ， He Mengjunl ， Yang Xul ， Li Xiangdong"2

Abstract

The helper component - proteinase （HC-Pro） gene of Sugarcane mosaic ViruS （SCMV） iso-late DWKl was cloned by RT-PCR， and ligated to prokaryotic expression vector pEHISTEV after enzymaticdigestion， producing the recombinant plasmid pEHISTEV-SCMV-HC-Pro. The recombinant plasmid wastransformed into Escherichia coli strain Rosetta， and expressed a fusion protein of 57 kD after induction withIPTG. The fusion protein was cut from the gel， emulsified and used to immumze the New Zealand long - earedwhite rabbits to produce polyclonal antiserum against SCMV HC - Pro. Titer of the antiserum was l：8192 whendetermined by indirect ELISA. SCMV HC-Pro could be detected even the extracts of DWKl-infected cornleaves were diluted at 128 times. Western-blot analysis showed that the antiserum could detect HC-Pro of i-solates DWKl （SCMV group I） and DWK2 （SCMV group IV） ， but had no cross reaction to that of Tobaccovein mosaic VLrUS and Potato virus Y belonging to the Potyvirus. This study provided solid foundation for thequick and precise detection of SCMV HC - Pro and will facilitate the study on function and mechanism of SC-MV HC-Pro.

Keywords Sugarcane mosaic ViuS; Helper component - proteinase; Prokaryotic expression; Antise-rum; Detection

玉米矮花葉病是威胁我国东北、华北、西南山区三大玉米产区的重要病害之一，其发生面积广、危害重、经济损失大，已成为限制我国玉米粮食作物生产的重要因素。据农业部全国农业技术推广服务中心“玉米病毒病治理对策研讨会”会议纪要报道，1996年玉米矮花叶病发病面积达2.33×106公顷，毁种绝产4×104公顷，产量损失5亿千克。

引起玉米矮花叶病的毒原有多种，其中甘蔗花叶病毒（Sugarcane mosaic Virus，SCMV）是引起我国玉米矮花叶病的主要病毒[1，2]。SCMV属于马铃薯Y病毒科（Potyviridae）马铃薯Y病毒属（Pot-yvirus），可以经蚜虫和种子传播。SCMV粒体为线状，基因组为正单链RNA，长约9600核苷酸，编码11个成熟蛋白[3]。其中辅助成分一蛋白酶为多功能蛋白，参与病毒蚜传、复制、移动等过程，具有RNA沉默抑制活性[4-6]。

根据全基因组序列比对结果，SCMV分为5组，其中以BD8、DWK2为代表的第Ⅳ组致病力强，在生产中的危害越来越大[7，8]。本研究目的是制备可以检测SCMV第1组和第Ⅳ组分离物HC-Pro、但与马铃薯Y病毒属其它病毒HC -Pro没有反应的抗血清。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

感染SCMV第1组分离物DWKI和第Ⅳ组分离物DWK2的玉米样品均采自山东省泰安市岱岳区大汶口镇（ N350 57'14. 05”，E1170 04'58. 66"）[9];原核表达载体pEHISTEV、大肠杆菌（Escherichiacoli）菌株Rosetta（ DE3）由英国安德鲁斯大学刘焕庭老师惠赠;大肠杆菌DH5α由本实验室保存。

Phusion DNA聚合酶、Western blot所用蛋白分子量标准购自Thermo公司;植物总RNA提取试剂盒TransZol、质粒小提试剂盒、PCR产物凝胶回收试剂盒为TransGen公司产品;限制性核酸内切酶、T4 DNA聚合酶、反转录酶、RNA酶抑制剂、Taq DNA聚合酶、dNTP购自TaKaRa公司;硝酸纤维素膜（NC）为Pall Gelman公司产品;羊抗兔IgG（碱性磷酸酯酶标记）、鼠抗兔IgG（辣根过氧化物酶标记）、福氏完全佐剂和福氏不完全佐剂购自Sigma公司;IPTG、DTT、甲醇等其它试剂为进口或国产分析纯。

1.2 引物设计

根据SCMV - DWK1序列（登录号KU171814）设计克隆SCMV - HC - Pro基因的引物，由上海生工生物工程有限公司合成。SCMV -HC - Pro基因克隆正向引物为SCMVHC一Pro -F：5- CGGGATCCGCTGATCCACAAGCGAATAG -3（下划线部分为BamH I酶切位点）;反向引物为SCMVHC—Pro- R：5- GGAGCTCTTATCCCAC-TATATATTCACGCATCTC -3（下划线部分为Sac I酶切位点），扩增片段长度约为1380 bp。

1.3 原核表达载体构建

参照TransZol试剂盒使用说明，提取DWK1玉米样品总RNA，以RNA为模板，选择随机引物进行反转录合成cDNA，利用引物SCMVHC—pro。一F、SCMVHC—Pro-R扩增SCMV - HC - Pro基因。PCR扩增程序为：98℃30 s;98℃ 10 s，65℃ 20 s，72℃1 min，30个循环;72℃10 min，18℃保存。PCR产物用1%的琼脂糖凝胶进行电泳分离，紫外灯下切取目的条带，经PCR产物凝胶回收试剂盒回收纯化后，用BamH I、Sac I进行双酶切，与相同酶切处理的pEHISTEV载体通过T4连接酶连接，转化大肠杆菌E.coli DH5α感受态细胞。采用PCR、酶切验证筛选阳性克隆，由济南博尚生物技术有限公司测序验证。

将测序验证后的阳性克隆提取质粒转化E.coli Rosetta菌株。挑取单菌落用3 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培养基于37℃培养12 h后，取1mL菌液加入150 mL含50 mg/L卡那霉素的LB培养基中，37℃、200 r/min振荡培养2.5～3 h，使OD600，值达0.4～0.6。将菌液分为两份，一份加入终浓度分别为0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0mmol/L的IPTG，于28℃、150 r/min诱导Sh;另一份加入终浓度为0.2 mmol/L的IPTG，于28qC、150 r/min分别诱导0、l、2、3、4、5、6h。4qC、12000 r/min离心10 min收集菌体，加适量TE缓冲液（pH8.0）振荡悬浮，再加入等体积的2×SDS上样缓冲液，沸水浴5 min，冰上放置5 min，4℃、12 000 r/min离心10 min，取10μL上清进行SDS - PAGE电泳检测蛋白表达情况，并利用软件BandScan 5.0分析融合蛋白HC - Pro表达量占细菌总蛋白的百分比。

1.4 抗血清制备、效价及特异性测定

原核表达的目的蛋白电泳后，用4 0C预冷的含0.25 mol/L KCl和1 mmol/L DTT的显色液进行染色，切取目的蛋白条带于预冷的研钵中，按1：1（W/V）加入0.9%生理盐水充分研磨。初次免疫目的蛋白需加入等体积的弗氏完全佐剂进行乳化，采取皮下多点注射新西兰长耳兔，一周后改用弗氏不完全佐剂进行蛋白乳化，以后每隔一周注射一次，共5次，最后一次免疫一周进行心脏取血，分离血清后，于-20℃长期保存。

利用间接ELISA法测定抗血清效价：将DWK1玉米样品按1：10（ W/V）的比例加入抗原包被緩冲液（0.05 mol/L碳酸盐缓冲液，pH9.6）充分研磨后，加入酶联板中，以相同的方法处理健康玉米叶片作为阴性对照。按照1：26～1：214对抗血清进行梯度稀释。显色后使用酶标仪读取OD405值，以I（待测样品读数一空白读数）/H（阴性样品读数一空白读数）≥2.0作为阳性反应[10]。

参照Towbin等[Il]的方法进行Western -blot，分析抗血清的特异性和灵敏度：以DWK1、DWK2玉米样品和分别感染烟草脉带花叶病毒、马铃薯Y病毒的普通烟以及pEHISTEV - SCMV -HC - Pro的原核表达产物为检测对象，以健康玉米叶片、普通烟叶片、pEHISTEV空载体的原核表达产物为阴性对照，测试抗血清的特异性;将DWKI玉米样品病汁液按照1：4、1：8、1：16、1：32、1：64、1：128、1：256、1：512稀释，以健康玉米叶片作为阴性对照，进行Western - blot分析。蛋白经SDS - PAGE电泳后于4qC转至NC膜，再用5%脱脂奶粉溶液将NC膜4qC封闭过夜。第二天，按1：500将制备的抗血清加入封闭液中，孵育、洗涤后加入HRP -鼠抗兔IgG稀释液中（1：50 000稀释）。将HRP - ECL化学发光所用A、B发光液按1：1混合，覆于NC膜上，用ChampChemi全自动化学发光仪观察结果。

2 结果与分析

2.1 SCMV - HC - Pro基因克隆及原核表達

通过RT - PCR从DWK1玉米样品中均克隆到1380 bp左右的特异性DNA条带，与预期大小相符（图1）。经BamH I、Sac I进行双酶切后连接到pEHISTEV载体，得到重组质粒pEHISTEV -SCMV - HC - Pro。

将重组质粒pEHISTEV - SCMV - HC - Pro转化E.coli Rosetta菌株，菌液经IPTG不同浓度和时间诱导，以pEHISTEV空载体原核表达产物为阴性对照，通过SDS - PAGE电泳检测目的蛋白表达情况，发现在57 kD左右出现一条明显的蛋白条带（图2、3），与预期结果一致，说明目的蛋白在E.coli Rosetta菌株中已成功表达。在IPTG浓度梯度中，当其浓度为0.2 mmol/L时蛋白即可表达，融合蛋白HC - Pro表达量约占细菌总蛋白的32.5%;增加IPTG浓度，对HC-Pro表达量无显著影响（图2）。WTG诱导1 h时融合蛋白即可表达，表达量约占细菌总蛋白的9.7%;随着诱导时间的延长，表达量增加;在诱导Sh时，融合蛋白HC -Pro表达量达到最大，占细菌总蛋白的32.8%;延长诱导时间，对表达量无显著影响（图3）。

2.2 抗血清制备及效价测定

原核表达的HC-Pro经SDS-PAGE分离后乳化，采取皮下多点注射免疫新西兰长耳兔，注射5次后获得SCMV HC-Pro抗血清。以DWK1玉米样品为试验材料进行效价测定，以健康的玉米叶片为阴性对照，利用间接ELISA法测得抗血清效价（表1），抗体在被稀释到8192倍时仍呈现明显的阳性，表明抗体具有较高的效价。

2.3 抗血清特异性检测

利用Western - blot分析抗血清特异性及灵敏度。结果显示，SCMV HC-Pro抗血清可同时对DWK1、DWK2玉米样品进行检测;制备的抗血清与马铃薯Y病毒属的烟草脉带花叶病毒和马铃薯Y病毒样品均无反应（图4）。在对pE-HISTEV-SCMV-HC-Pro原核表达产物检测时，由于原核表达的SCMV-HC-Pro基因携带His标签，所以其大小较野生型病毒大，符合预期结果（图4）。将DWK1样品病汁液稀释128倍时，利用制备的抗血清仍然能够检测到病毒（图5）。综上结果，本研究制备的抗血清具有较高的特异性及灵敏度。

3 讨论与结论

梁新苗等[12]利用原核表达载体pET22b（+）表达了SCMV北京分离物的HC-Pro基因，用原核表达产物制备的抗血清可用于检测SCMV北京分离物的HC-Pro;以发病玉米汁液为抗原，效价可达1：4096。本研究利用原核表达载体pE-HISTEV表达了SCMV第1组分离物DWK1的HC-Pro基因，表达蛋白占菌体总蛋白的32.5%。利用大肠杆菌Rosetta（DE3）表达的HC-Pro蛋白制备抗血清，效价为1：8192。该血清可检测SCMV第1组分离物DWK1和第Ⅳ组分离物DWK2的HC - Pro;当感染DWKI的玉米植株病汁液稀释到128倍时，该抗血清仍能对SCMVHC-Pro进行检测，且该抗体与同为马铃薯Y病毒属的烟草脉带花叶病毒、马铃薯Y病毒样品均无反应。

少数情况下，通过SDS凝胶电泳分离蛋白制备的抗体可能无法对未变性蛋白进行检测。这可能是由于蛋白变性、空间构象被破坏导致抗原决定簇发生改变，抗原与抗体无法特异性识别[13]。本研究制备的抗体可用于对SCMV HC-Pro进行ELISA和Western Blot检测。

本研究制备的抗血清具有较高的特异性、灵敏度，为SCMV HC-Pro检测、功能和作用机理研究提供了重要的物质保证。

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