方 哲 陈素红 方 慧 苏 洁 吕圭源

衰老是机体内器官及生理机能逐渐衰退，功能下降和紊乱的综合表现。随着老年人口不断增长，人口老龄化问题已成为国际社会面临的严峻问题[1]。中医在对抗衰老中药研究中，总结出许多延缓衰老的方剂和制剂，据《圣济总录》、《寿亲养老新书》等记载，草还丹、人参固本丸和二至丸是由多味味甘，入肝、肾经中药组成的复方制剂，具有补益肝肾、固本延年之功效。有报道表明，二至丸水煎剂具有一定的抗衰老作用[2-4]，但较少对多脏器进行相关研究。草还丹和人参固本丸的抗衰老作用的现代药理研究的文献较少，亦无其他学者报道关于多种中药复方的抗衰老作用规律。本研究通过观察草还丹、人参固本丸和二至丸三种中药复方水煎剂对衰老小鼠体征、自主活动、学习记忆能力、抓力、骨强度、血脂、性腺系数的影响，探讨抗衰老作用规律。

1 实验材料

1.1 动 物 健康ICR小鼠，6周龄，体质量18～20g，雌雄各半由浙江省医学科学院动物供应中心提供[合格证号 SCXK（浙）2008-0033]。常规饲喂，自由进食、饮水，期间保持通气良好，温度21～26℃，湿度50%～70%。

1.2 药物与试剂 本实验所用二至丸（女贞子、旱莲草各80g）、草还丹（菊花、巴戟天、枸杞子、肉苁蓉各40g）和人参固本丸（天冬、麦冬、熟地黄、生地黄各40g，人参20g）所需中药饮片均购自浙江中医药大学中药饮片厂，并由浙江中医药大学药物研究所制备成含生药量为0.45g/mL的药液[5]。D-半乳糖（上海恒信化学试剂有限公司，批号20090106，用灭菌的生理盐水配成浓度为10mg/mL注射液）；维生素E软胶囊（杭州华东医药集团新五丰药业有限公司，批号080402，置于蒸馏水中，用吐温-80助溶，超声振荡配成浓度为3.5mg/mL的乳白色混悬液）；高密度脂蛋白胆固醇（HDL-C）试剂盒（批号 ZGM09132）、甘油三酯（TG）试剂盒（批号 P090611）、胆固醇（TC）试剂盒（批号 P090321）、葡萄糖（GLU-OX）试剂盒（批号P090441）均购于上海复兴长征医学科学有限公司。

1.3 仪 器 SELECTRA-E全自动生化仪：荷兰威图公司；YSL-13A大小鼠抓力测定仪、YLS-1多功能小鼠自主活动记录仪、YLS-16A小动物骨骼强度测定仪：山东省医学科学院设备站；Morris水迷宫：中国医学科学院药物研究所。

2 实验方法

2.1 分组与给药 72只ICR小鼠随机分为正常对照组、模型组、草还丹组、人参固本丸组、二至丸组和维生素E组，每组12只（雌雄各半）。正常对照组颈背部皮下注射生理盐水，其余各组按100mg·kg-1·d-1剂量颈背部皮下注射D-半乳糖[6]，造模同时，阳性对照组按50mg/kg剂量灌胃给予维生素E[7]，各中药复方组给药剂量按文献[4]中给药剂量经实验动物“等效剂量”的计算方法计算。各复方组以4.5g·kg-1·d-1剂量灌胃给药，正常对照组和模型对照给予等体积蒸馏水，连续42天，每3天称重1次。

2.2 观察指标及检测 （1）水迷宫：造模给药第37d进行小鼠水迷宫实验评价小鼠学习、记忆能力。Morris水迷宫中注入清水，使水面高出站台表面0.5cm。水温控制在（22±0.5）℃，在水池上标定相同一点作为每次实验小鼠的入水点。站台置于离入水点较远的象限中间，实验过程保持站台位置不变。每次实验以120s为限，记录小鼠从入水点到达站台所需时间以及在这段时间内的游泳路程和速度，以所需时间作为学习和记忆成绩，若设定时间内未找到站台，则以120s记。正式测定前，以相同方式适应性预实验1周。（2）自主活动：造模给药第38天测小鼠自主活动评价小鼠活跃程度。将小鼠置于自主活动仪内预适应5min后，记录实验动物在10min内活动次数。（3）抓力及骨强度：造模给药第40天测小鼠抓力。持抓小鼠尾根处，置于抓力板上进行测定，测定两次取平均值。末次给药后，取小鼠后肢大腿骨，剔除附着肌肉与韧带，将骨骼置于骨骼强度测定仪内，骨骼受到最大压力断裂，读取骨强度数值。（4）血生化指标：末次给药后禁食24h，眼眶取血，室温静置2h后，3000r/min离心10min分离血清。测定GLU-OX、TC、TG、HDL-C。根据公式计算：LDL-C=TC-HDL-C-TG/2.2。（5）脏器系数：将小鼠解剖，取睾丸、精囊腺，计算系数（系数=脏器重量/体质量×100）。

3 实验结果

3.1 一般状况观察 正常对照组小鼠毛色光亮、毛发浓密，喜动而不喜卧，皮肤弹性良好。模型对照组小鼠毛色蜡黄，皮肤松驰，弹性下降，四肢疲软无力，行动迟缓，喜蜷缩而不喜动。三个复方组在实验前期（给药第1～3周）出现与模型组小鼠相同体征，但在后期（给药第4～6周）逐渐恢复正常。提示可能是三个复方均入肾经，肾其华在发，甘补可缓解衰老引起的毛发萎黄，精神萎靡症状。

3.2 各组小鼠自主活动、抓力及悬尾时间比较 与正常对照组比较，模型组自主活动、抓力、骨强度明显下降（P＜0.05）。与模型组比较，各组均能提高衰老小鼠抓力、骨强度；草还丹和人参固本丸可提高自主活动次数（P＜0.05，P＜0.01），见表 1。

表1 各组小鼠自主活动、抓力、骨强度比较

表1 各组小鼠自主活动、抓力、骨强度比较

注：“-”无剂量；与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别正常对照组模型组草还丹组人参固本丸组二至丸组维生素E组剂量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05鼠数12 12 12 12 12 12自主（次数）381.08±53.66 346.58±41.06*405.75±62.17△△381.17±50.40△379.45±52.85 412.42±65.58△△抓力（g）173.92±35.32 154.48±13.15*189.52±55.50△184.26±29.57△△173.98±29.53△187.63±62.42△骨强度（kg）1.85±0.34 1.60±0.22*1.96±0.41△△1.84±0.34△1.82±0.30△2.03±0.59△

3.3 各组小鼠学习记忆能力比较 与正常对照组比较，模型对照组持续时间、总路程明显延长（P＜0.05），在第一、四象限持续时间显著延长（P＜0.05）；与模型组比较，各复方组可不同程度减少持续时间、总路程及在各象限中持续时间（P＜0.05，P＜0.01），见表2-3。

表2 各组小鼠水迷宫实验结果比较

表2 各组小鼠水迷宫实验结果比较

注：“-”无剂量；与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别正常对照组模型组草还丹组人参固本丸组二至丸组维生素E组剂量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05鼠数12 12 12 12 12 12持续时间（s）32.65±25.90 57.60±32.32*25.75±16.45△△29.82±16.52△△20.18±10.29△△30.80±18.98△总路程（cm）486.04±377.76 816.63±465.42*397.11±235.31△△399.70±206.51△△268.69±99.85△△449.55±296.27△

3.4 各组小鼠血糖、血脂水平比较 与正常对照组比较，模型组血清GLU-OX、TC、TG及LDL-C 明显升高，HDL-C 明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，三个中药复方组可明显降低TG、TC及LDL-C，升高HDL-C（P＜0.05，P＜0.01）；草还丹和人参固本丸可降低 GLU-OX（P＜0.05，P＜0.01），见表 4。

3.5 各组小鼠睾丸、精囊腺系数比较 与正常对照组比较，模型组睾丸系数和精囊腺系数明显降低（P＜0.05，P＜0.01）。与模型组比较，人参固本丸组、二至丸组能提高睾丸系数（P＜0.05）；草还丹组和人参固本丸组能提高精囊腺系数（P＜0.05），见表 5。

4讨 论

中医认为，脏腑虚衰是导致衰老、死亡的原因，其中肝肾虚衰与衰老关系密切，肾虚为主、血瘀为辅是导致衰老的原因，疏肝益肾可延缓衰老[8]。草还丹以味甘性温、补肾助阳巴戟天为君药，辅以味甘温阳肉苁蓉和枸杞，具有温补肝肾，益气壮骨，固本延年之功效；人参固本丸按天（天门冬）、地（生地黄、熟地黄）、人（人参）配置，诸药味甘补益，共奏补血益气，生精固本，延年益寿之药效。二至丸以性凉的女贞子为君药，臣以性凉的墨旱莲，补益肝肾，滋阴止血。已有报道提示二至丸具有一定的抗衰老作用[2-5]。

表3 各组小鼠水迷宫实验结果比较

注：“-”无剂量；与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01

组别正常对照组模型组草还丹组人参固本丸组二至丸组维生素E组剂量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05第一象限时间6.74±7.15 15.60±11.23*6.68±5.90△7.76±5.88△3.49±2.99△△8.13±6.09△第二象限时间8.25±6.53 13.51±9.32 4.99±2.64△△9.85±6.04 6.02±3.78△7.49±5.13△第三象限时间8.66±6.23 12.66±7.06 4.88±4.28△△6.56±4.98△4.83±2.75△△5.76±5.29△△第四象限时间8.59±7.74 15.84±8.63*9.20±6.04△5.65±4.03△△5.84±4.52△△9.42±6.32△鼠数12 12 12 12 12 12

表4 各组小鼠血糖、血脂比较（mmo/L

表4 各组小鼠血糖、血脂比较（mmo/L

注：“-”无剂量；与正常对照组比较，*P＜0.05；与模型对照组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；GLU-OX：葡萄糖；TG：甘油三酯；TC：总胆固醇；HDL-C：高密度脂蛋白胆固醇；LDL-C：低密度脂蛋白胆固醇

组别正常对照组模型组草还丹组人参固本丸组二至丸组维生素E组剂量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05鼠数12 12 12 12 12 12 GLU-OX 3.68±0.90 4.48±0.63*3.10±0.86△△3.38±0.96△△3.93±1.05 3.87±1.03 TG 0.96±0.34 1.26±0.25*1.03±0.21△1.04±0.25△1.07±0.19△0.98±0.29△TC 2.19±0.72 2.86±0.74*2.27±0.59△2.25±0.53△2.42±0.32△2.77±0.98 HDL-C 0.86±0.14 0.76±0.11*0.92±0.19△0.86±0.16△0.92±0.14△△0.94±0.26△LDL-C 0.89±0.63 1.52±0.77*0.86±0.54△0.91±0.44△1.02±0.26△1.39±0.79

表5 各组小鼠睾丸、精囊腺系数比较（%

表5 各组小鼠睾丸、精囊腺系数比较（%

注：“-”无剂量；与正常对照组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05

组别正常对照组模型对照组草还丹组人参固本丸组二至丸组维生素E组剂量（g/kg）--4.50 4.50 4.50 0.05鼠数666666睾丸系数0.826±0.077 0.679±0.042**0.735±0.080 0.810±0.112△0.754±0.087△0.771±0.094△精囊腺系数0.538±0.130 0.416±0.085*0.570±0.156△0.548±0.138△0.473±0.153 0.560±0.140△

D-半乳糖能使细胞内半乳糖浓度增高，进而生成不能被细胞代谢的半乳糖醇，以致细胞损伤、代谢紊乱，使多器官功能减退，最终导致衰老[9]。研究表明，D-半乳糖所致衰老模型在抗衰老研究中应用广泛，具有衰老变化明显，症状全面，模型稳定等特征[10]。

本研究结果显示，三个中药复方能提高小鼠抓力、骨强度，这些作用可能与三种中药复方入肝肾经有关，肝主筋、肾主骨，发挥补肝益肾、强筋健骨之作用从而改善衰老导致的肾虚之腰膝酸软。草还丹和人参固本丸能提高自主活动次数，改善精神萎靡症状，二至丸效果不显著，可能与二至丸性凉，草还丹与人参固本丸性温有关，需进一步研究。衰老可导致健忘，思维敏捷性降低，学习能力下降等。实验结果表明，给予中药复方治疗后小鼠学习记忆能力明显改善。这可能是肾与心关系密切，体现在水火既济以及君火相火，所以心火可防止肾水过寒，同时制约相火[11]。脂质代谢的能力及氧自由基清除能力随机体的老化而退化，血液内脂类物质堆积，诱发多种疾病的发生及重要器官的衰老，高血脂等因素与衰老常互为因果，相互促进[12]。实验结果表明，D-半乳糖致衰老小鼠血清GLU-OX、TC、TG及LDL-C含量明显升高，HDL-C含量则明显下降，这与自然衰老时血脂的变化相同。三个中药复方组能不同程度的改善血脂异常情况。这可能与之“入肝肾，肝主疏泄，主藏血，调畅气机之功”有关。

实验动物的脏器系数是药物非临床研究中重要的参考指标[13]，脏器系数可以反映器官的结构变化，也间接说明脏器本身的功能。有研究表明，D-半乳糖可诱导生殖功能退化[11]。本实验结果显示，经过D-半乳糖注射后，雄性大鼠的睾丸、精囊腺系数降低，表明器官出现老化、功能下降，加速了小鼠衰老；三个中药复方组能不同程度的改善衰老小鼠睾丸、精囊腺系数。

综上所述，草还丹、人参固本丸和二至丸可通过改善衰老所致精神萎靡、强筋健骨、增强记忆学习能力及提高性腺指数等症状起到延缓衰老作用，该作用可认为是这三种中药复方抗衰老药效的共同规律，二至丸与草还丹、人参固本丸的作用略有差异，可能与二至丸“性凉”而草还丹、人参固本丸“性温”有关，但需进一步研究。