草莓抗枯萎病分子标记初定位

2019-07-25史芳芳

湖北农业科学 2019年13期

史芳芳

（新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所，乌鲁木齐 830088）

草莓（Fragaria×ananassa Duch.）是具有较高经济价值的重要浆果之一，随着草莓设施栽培产业的发展，草莓连作病害日趋严重。草莓枯萎病就是连作病害中的主要病害之一，可导致草莓产量和品质的大幅度降低，严重危及草莓产业的发展。草莓枯萎病是由尖孢镰刀菌草莓专化型（Fusarium oxysporum f.sp.fragariae）寄生引起的一种真菌土传病害，通过侵染根部在维管束内蔓延，然后堵塞其导管并分泌有毒物质，最后造成叶片萎蔫直至植株枯萎死亡［1］。病菌通过种苗、土壤、灌溉水和农具等方式传播，可在苗期或开花至收获期发病，植株一旦发病会造成结果减少，果实不能正常膨大，品质变劣，产量大幅度降低等，严重影响草莓产业的发展［2，3］。近年来，随着国内草莓设施栽培面积的不断扩大，草莓枯萎病在中国的一些主要种植区均有发生，危害也有逐年加重的趋势［4］。

目前，国内外对枯萎病等真菌病害的防治主要依赖于化学药剂，这无疑会给广大消费者的食品安全带来威胁，而且常常防治效果不佳。另一方面，长期大量使用农药会对环境造成不良影响。改变这种不利局面的最直接、经济有效的措施就是培育抗枯萎病草莓新品种。定位相关的抗病基因是培育草莓抗病新品种的基础，在番茄、西瓜、棉花、黄瓜等农作物中有枯萎病相关抗性基因定位的报道，对草莓抗性基因研究较多的主要有草莓白粉病、灰霉病、炭疽病等抗病基因［5-8］，而目前对于草莓枯萎病抗性基因的遗传特性及其相关基因分子标记的研究仍较少。为此，试验在前人对草莓中SSR分子标记的研究基础上，对草莓抗枯萎病的相关基因进行初步定位，期望能够找到与抗病基因紧密连锁的分子标记，为未来的分子标记辅助育种，筛选优良抗病品种奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

试验中草莓亲本红颜、甜查理、紫金四季、宁玉、紫金香玉、章姬由新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所草莓种苗繁育基地提供，后代优系由江苏省农业科学院提供。抗病鉴定所用草莓枯萎病病原菌经形态学和分子生物学鉴定分析为镰刀菌。亲本及优系后代均种植于新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所育苗网室冷棚。

1.2 方法

1.2.1 苗期枯萎病抗性分析按照文献［9］中抗病性鉴定方法，采用苗期人工灌根接种鉴定法和叶片离体培养法。试验接种所用病原菌分离自草莓感病根部，样本采自新疆生产建设兵团第十二师农业科学研究所草莓育苗基地有典型症状的感病植株，结合形态学鉴定和柯赫法则验证为草莓枯萎病病原菌。

于草莓子苗有3片完全展开叶片时采用灌根法，慢慢灌根接种，每一营养钵接种孢子悬浮液50 mL。接种后在25℃、高湿环境条件下培养。每一株系重复4次，每重复5株，计20株。接种后12～15 d进行调查，根据植株感病症状对病株进行病情分级。按感病叶片数占调查总叶片数的百分率分感病等级。感病等级划分为0～6级（图1），等级0、1、2、3 级划为抗病类型，等级 4、5、6 级划为感病类型。

图1 枯萎病抗性鉴定等级

1.2.2 抗病基因的获得参考草莓抗病基因相关文献，合成抗病相关基因引物NBS-1F：5′-CCCCCTCA ACACCTTTCCTTTTCT-3′，NBS-1R：5′-CAATCCCTG CGAGACAGAGATGAA-3′。提取父本、母本及后代优系DNA，采用25 μL PCR扩增反应体系，其中包括 1μL（约 50ng）模板 DNA、12.5 μL PCR buffer mix（含 Mg2+）、0.4 μmol／L 引物（上、下引物各 1 μL）、Taq DNA 聚合酶 0.4 μL、ddH2O 9.1 μL。 PCR 反应程序：94℃预变性 4 min；94℃变性 30 s，55℃退火45s，72℃延伸 1min，35个循环；最后72℃延伸5min。扩增产物用1%琼脂糖凝胶电泳验证能否扩增出抗病全长基因。

1.2.3 SSR标记分析试验选取20对蔷薇科SSR引物，引物序列参考已发表的文献［7，8］，引物由上海生工生物工程技术服务有限公司合成。采用25 μL PCR 扩增反应体系，其中包括 1 μL（约 50 ng）模板DNA、12.5 μL PCR buffer mix（含 Mg2+）、0.4 μmol／L引物（上、下引物各 1 μL）、Taq DNA 聚合酶 0.4 μL、ddH2O 9.1 μL。

1.2.4 多态性分子标记筛选 20对引物以亲本为模板，筛选出两亲本之间表现多态性的引物，再对8个后代优系进行分析。在后代产生差异且在两亲本间（高抗和高感亲本）也存在差异条带的引物组合即初步认为是与抗枯萎病基因连锁的SSR分子标记。

2 结果与分析

2.1 抗病性鉴定与遗传分析

采用人工灌根法和叶片培养法进行抗病试验，调查枯萎病的发病情况，结果见表1。灌根法和叶片培养法试验显示，后代13-52-407和13-53-100具有很强的枯萎病抗性，抗性较强的两个后代的亲本均为章姬和甜查理，这可能遗传了亲本甜查理抗病性较强的特性，而13-65-265抗病性较差，其亲本为紫金香玉与红颜，可能后代遗传了亲本红颜抗病性较差的特性，抗病性表现如图2和图3所示。

2.2 抗病基因NBS的扩增结果

通过NBS引物首先对亲本进行PCR扩增，扩增产物凝胶电泳结果显示，紫金四季和甜查理扩增获得一条约2 500 bp的特异条带，对此扩增产物进行测序分析，测序结果表明NBS全长2 434 bp，基因组 DNA 包括 3 个外显子，依次长 629、780、682 bp，2个内含子分别长240 bp和103 bp。接着对父本和母本为紫金四季和甜查理的优系进行后代抗病性遗传分析，优系13-53-100、13-52-407也扩增到此条带，如图4所示。结果表明抗病性基因筛选结果与“2.1”的抗病性试验结果一致。

表1 亲本及后代材料抗感鉴定结果

图2 叶片抗病性试验

图3 灌根法抗病性试验

2.3 STR微卫星分析

用20对引物对父本和母本进行分析，结果显示其中10对引物表现出多态性，分别为引物FSS6、FSS8、FSS50、FSS61、FSS65、FSS121、FSS128、FSS139、FSS143、UFFxa01H05，具体见表2。将这些筛选出的10对引物再对其优系后代进行分析，其中引物FSS121在后代13-52-407中扩增出与母本甜查理一致的多态性条带，条带大小为193 bp和202 bp，其他引物扩增出杂合带，即出现与父本和母本不一致的条带。通过微卫星分析初步判断，后代13-52-407遗传了亲本甜查理的抗病性（图5）。

图4 抗病性基因扩增结果

表2 SSR引物序列

3 小结

草莓抗病育种已经成为国内国际草莓育种人的育种目标之一，抗病性筛选的方法最初为人工喷雾和灌根等方法，最近几年利用抗病基因和抗病分子标记筛选成为抗病性鉴定的主要手段。通过分子辅助育种能够快速培育出持久抗性品种，该方法是加快草莓育种和提高育种水平的措施之一。国内对草莓抗病相关分子标记及抗病基因的研究主要集中在草莓白粉病［7，10］、灰霉病［6，8］及炭疽病［11］等病害上，鲜有关于枯萎病抗病性鉴定的研究，所以本研究对于草莓抗枯萎病的研究具有重要的参考价值。

本研究通过人工抗病试验筛选，结合抗病基因检测，初步确定了草莓优系后代13-52-407和13-53-100具有较强的抗病性，验证了筛选出的这2个优系遗传了亲本甜查理的抗病性，这与其他对于高抗亲本甜查理的研究一致［6-8，10，11］，充分证明了甜查理可作为草莓抗病育种的首选高抗亲本。分子标记（微卫星）分析结果只显示优系后代13-52-407遗传了亲本甜查理的抗性，而未显示13-53-100的抗性标记，这可能与分子标记引物筛选范围不广泛有关，后续将继续开展此项工作。对于其他甜查理作为亲本的后代优系没有发现明显的抗病性，分析原因可能是因为孟德尔规律，性状在后代发生了分离。