扎西穷达，刘吉爱，曹叶伟，王军

1(西藏自治区食品药品检验研究院，西藏 拉萨，850000) 2(中国农业大学 食品科学与营养工程学院，北京，100083)

酥油在藏族人民饮食结构中扮演着重要的角色[1]。牦牛酥油是牦牛乳发酵后提炼得到的，具有独特的风味和丰富的营养，深受藏族同胞的喜爱[2-3]。在青藏高原地区，每年7～9月盛产牦牛酥油，具有独特的口感和香气。牦牛酥油的营养价值高，又具有一定的特殊功能，越来越受到国内外学者的关注。目前有关牦牛酥油中功能脂肪酸和挥发性风味物质的相关研究很多[4]。其中，研究发现西藏牦牛酥油中的游离脂肪酸含量明显高于其他奶类脂肪，藏牦牛酥油中的亚麻酸比普通奶油高3倍[6]，亚油酸是普通奶油的2倍多[7-8]，二十碳五烯酸(EPA)、二十二碳六烯酸(DHA) 仅存于牦牛酥油中[5]。对牦牛酥油挥发性风味物质的研究，主要集中在利用固相微萃取(solid-phase microextraction, SPME)富集后利用气相色谱-质谱联用进行定性分析。薛璐等采用固相微萃取顶空气相-质谱法测定了内蒙酥油中的风味物质，在内蒙古酥油中共检出22种挥发性风味物质[9]。HU等[10]和鲁玉侠等[11]利用气相色谱-质谱联用技术在牦牛酥油中鉴定出了28种不同的风味物质等。牦牛酥油风味独特，但仍然缺乏其挥发性风味物质与普通奶油之间的差别分析，以及是否含有特征风味成分的研究报道。牦牛酥油经发酵而成，与其他奶油加工工艺不同[12]，具有独特风味。但仅从外观形状和色泽无法将其与其他奶油类样品进行区分，因此市场上存在着将其他奶油类产品与牦牛酥油混淆的情况。因此，需要研究牦牛酥油与其他奶油产品间挥发性物质的差异，寻找它们之间的关键的差别物质，为区分牦牛酥油与其他奶油制品提供依据。

同时蒸馏萃取法(simultaneous-distextraction, SDE)在食品挥发性风味物质的研究具有较好重复性，操作简便、富集效果好、受基质影响小[13-15]。本研究利用同时蒸馏萃取法对牦牛酥油中挥发性物质进行提取和富集，再利用气相色谱-质谱仪进行分析，对牦牛酥油和其他奶油类样品中的挥发性物质进行分析比较，寻找牦牛酥油中存在的特征挥发性物质，并对其进行定量分析。

1 材料

1.1 试验材料

试验材料如表1所示。

1.2 实验仪器、标准对照品和试剂

7890B-597气相色谱-质谱联用仪分析色谱仪，美国安捷伦公司；同时蒸馏萃取装置，安徽东冠设备有限公司；恒温电热套，力辰科技；旋转蒸发仪，上海亚荣生化仪器厂；万分之一天平(感量0.000 1g)，英国Adam公司。

标准对照品：乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯，北京百灵威科技有限公司；戊酸乙酯、TCI，化成工业发展有限公司。

表1 样品信息Table 1 Sample information

试剂：二氯甲烷、乙酸乙酯、正己烷(色谱纯)，北京百灵威科技有限公司；无水Na2SO4(分析纯)，北京康普汇维科技有限公司。

2 试验方法

2.1 样品制备

2.1.1 定性分析样品制备

称取20 g样品于圆底烧瓶中，加蒸馏水50 mL，并加入少许沸石，在萃取瓶中加入50 mL萃取溶剂乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷)，装入同时蒸馏萃取装置，设置恒温电热套温度，使两端萃取瓶温度处于微沸状态，蒸馏萃取一定时间后冷却，然后将萃取液用无水Na2SO4干燥去水，旋转蒸发浓缩至1 mL左右，再用萃取溶剂定容至2.0 mL,用0.22 μm有机相滤膜过滤后进行GC-MS分析。

2.1.2 定量分析样品制备

准确称取20 g样品(精确到0.1 mg)于圆底烧瓶，加蒸馏水50 mL，并加入少许沸石，在萃取瓶中加入50 mL二氯甲烷，装入同时蒸馏萃取装置，设置恒温电热套温度，两端萃取瓶温度处于微沸状态，蒸馏萃取4 h，冷却后，然后将萃取液用无水Na2SO4干燥去水，旋转蒸发浓缩至1 mL左右，加入20 μL 1 mg/mL戊酸乙酯(内标)，用二氯甲烷定容到2.0 mL，用0.22 μm有机相滤膜过滤后用GC-MS进行定量分析。

2.1.3 标准对照品制备

标准工作液：准确量取乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯标准溶液，用二氯甲烷稀释至刻度，制成质量浓度为1 mg/mL的标准工作溶液。

内标标准工作液：准确量取戊酸乙酯液，用二氯甲烷稀释至刻度，制成质量浓度为1 mg/mL的内标工作液。

2.1.3.3 标准曲线的制备:精密量取上述标准工作液，用二氯甲烷稀释至1.0 mL，制成质量浓度为1.0、2.0、5.0、10.0、20.0和50.0 μg/mL的标液，加入的内标质量浓度为10 μg/mL。

2.2 仪器条件

2.2.1 色谱条件

色谱柱：DB-wax柱(30 m×250 μm×0.25 μm)；进样口温度：250 ℃；流速：1.5 mL/min；柱温：40 ℃保持4 min，5 ℃/min上升到100 ℃保持2 min，3 ℃/min上升到150 ℃，10 ℃/min上升到230 ℃保持8 min；进样量：1 μL；进样方式：分流模式(分流10∶1)。

2.2.2 质谱条件

2.2.2.1 定性分析质谱条件

接口温度：240 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；扫描模式：SCAN；电离方式：EI。

2.2.2.2 定量分析质谱条件

接口温度：240 ℃；离子源温度：230 ℃；四极杆温度：150 ℃；扫描模式：SIM；电离方式：EI；定量分析：SIM分析，条件见表2。

表2 SIM分析条件Table 2 The condition of SIM scan

2.3 分析方法

2.3.1 挥发性物质定性分析

通过气相-质谱仪分析出总离子流图，通过保留时间和NIST谱库检索，选取匹配度均大于800的进行化合物鉴定，该结果为定性结果。

2.3.2 乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯定量分析

样品经过同时蒸馏萃取后以戊酸乙酯为内标，采用内标法对这3种酯类进行定量分析。

3 结果与分析

3.1 特征挥发性成分定性

3.1.1 萃取溶剂优化

选取酥油1样品以同时蒸馏萃取法(SDE)萃取挥发性物质，分别用乙酸乙酯、正己烷和二氯甲烷3种不同极性的溶剂[16-18]萃取，分析对比萃取液GC-MS总离子流图，酥油1样品不同萃取液的气-质联用分析总离子流色谱图见图1。

图1 采用不同萃取溶剂的SDE方法萃取得到的挥发性物质气质联用总离子流色谱图Fig.1 The total ion chromatogram of volatile compounds by SDE with different extracting solvents

由图1分析比较得出，3种萃取溶剂中，二氯甲烷溶剂的极性适中，同时蒸馏萃取过程中萃取到的样品所含的挥发性物质种类最多，色谱峰面积较大，故本方法选用二氯甲烷作为同时蒸馏萃取溶剂，采用SDE法对各种牦牛酥油和其他类奶油制品中的挥发性物质进行定性分析。

3.1.2 牦牛酥油和其他类奶油挥发性成分对比

6种牦牛酥油类样品和8种奶油类样品中挥发性物质定性分析见表3。

表3 牦牛酥油和其他奶制品中挥发性物质定性分析Table 3 The qualitative analysis of volatile compounds in yak butter and other similar dairy products

续表3

分类化合物名称牦牛酥油其他类酥油1酥油2酥油3酥油4酥油5酥油6奶油黄油蛋糕奶油奶酪再制干酪稀奶油植物黄油加盐黄油酯类丁位十二内酯++----++-+++++丁位十四内酯+-----++--+-++丁位癸内酯++++++++-+++++油酸甲酯--+-----------棕榈酸甲酯-----------+--亚油酸乙酯--+-----------月桂酸乙酯----+---------酮类2-戊酮++++-+-+------2-己酮--+-----------2-庚酮++++++++++++-+2-壬酮++++++-+++++-+8-壬烯-2-酮--+-----------2-十一酮++++++++++++++2-辛酮--+--+-----+--2-十三酮------+-+-----2-十五酮--------+-----2-十三烷酮++++++-+-+++++2-十五烷酮++++++++-+++++3-羟基-2-丁酮----++---++++-醇类2-戊醇-++--+--------2-庚醇---+++--------正丁醇--------------苯甲醇--+-----------糠醇--+---+--+++--2-壬基醇-----+--------烷类十二烷+---+++-------十四烷--+-+++-------十五烷+-+-+---------十七烷----+----+----十八烷----+--------+十九烷----+---------二十一烷----+---------二十四烷----+---------二十六烷----+---------二十七烷----+---------二十八烷----+------- --醛类壬醛---------+-- --糠醛+--++---+-----苯甲醛--------+-----其他类甲苯++++--++++----苯乙烯-+----+-------N,N-二甲基甲酰胺-+-+--+-+-++--N,N-二甲基乙酰胺-+-+---++-----1,3-二叔丁基苯-----+--------苯胺-----+------++合计343136283325141813141512912

注：“+”表示样品中检测到该化合物质，“-”表示样品中未检测到该化合物质。

从表3分析看出，牦牛酥油中共鉴定出65种挥发性物质，其中酸类19种，酯类12种，烷类11种，酮类10种，醇类5种，醛类1种，其他类6种；其他类奶油样品中共鉴定出41种挥发性物质，其中酸类9种，酯类8种，烷类4种，酮类10种，醇类1种，醛类3种，其他类5种。鉴定化合物中酸类和酯类所占比例最高。不同牦牛酥油的制备方法略有不同，所以挥发性风味物质的种类并不完全相同，但大多数含乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯3种酯类，而这些特征性酯类物质在8种其他奶油类样品中都未检测到。乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯可作为牦牛酥油特征性挥发性物质，这些物质的产生与牦牛酥油制备时特殊的发酵工艺密切相关[19-23]。可进一步通过内标标准曲线建立酥油中这些特征挥发性物质的定量方法，为牦牛酥油的鉴别和品质评价提供参考。

3.2 定量分析方法

3.2.1 萃取时间对定量结果影响

为了探究二氯甲烷萃取溶液是否将牦牛酥油中的特征挥发性物提取完全，对不同蒸馏萃取时间进行优化研究，分别研究1、2、3、4、5、6 h的效果。乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在不同萃取时间的提取效果见图2。

从图2可看出，在1～4 h内，乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯的质量浓度逐渐上升，4～6 h，曲线趋于平稳，表明萃取4 h左右时，可将牦牛酥油中的这3种特征挥发性物质提取完全，故本方法采用4 h蒸馏萃取。

3.2.2 线性关系和检出限

配制标准溶液质量浓度1.0～50.0 μg/mL，加入内标溶液浓度10.0 μg/mL，采用内标法绘制标准曲线。称取20.0 g左右样品，经同时蒸馏萃取后定容至2.0 mL，根据S/N=3分别计算出这3种酯类的检出限，乳酸乙酯0.13 μg/kg、辛酸乙酯0.18 μg/kg、癸酸乙酯0.17 μg/kg，详见表4。

表4 标准曲线线性与检出限Table 4 The standard curve and limit of detection

本方法线性关系R2≥0.997，线性关系良好；检出限值低，灵敏度高。

3.2.3 准确性和精密度

向酥油1样品中分别加入0.05、0.02、0.01 mL乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯标准溶液(质量浓度为1.0 mg/mL)，各做3份平行处理，实际加入量为高、中、低3个不同浓度：2.5、1.0、0.5 mg/kg，进行回收率测定，结果见表5。

表5 回收率与相对标准偏差(RSD)(n=3)Table 5 The recovery and relative standard deviation

从表4可以看出，乳酸乙酯回收率在86.7%～104.7%，相对标准偏差(RSD)在1.14%～1.37%；辛酸乙酯回收率在89.3%～105.7%，相对标准偏差(RSD)在0.66%～1.37%；癸酸乙酯回收率在83.3%～89.5%，相对标准偏差(RSD)在0.59%～1.77%。

酥油1号样品，同时蒸馏萃取处理5份，分析乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量，进一步得到本方法测定的样品的精密度，结果见表6。

表6 样品分析相对标准偏差(RSD)(n=5)Table 6 The relative standard deviation of sample analysis

由表6可以看出，方法相对标准偏差乳酸乙酯为1.32%，辛酸乙酯为1.80%，癸酸乙酯为2.08%。本方法具有较好的线性关系，灵敏度高、准确性好，适合牦牛酥油中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯等特征挥发性成分的定量分析。

3.2.4 牦牛酥油特征性挥发性物质定量分析

用戊酸乙酯做内标物质，对酥油1、酥油2、酥油3、酥油4、酥油5和酥油6六种不同品质的牦牛酥油样品中的乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯进行定量分析，为了更好的消除基质干扰，准确定量，根据这3种酯类保留时间和质荷比的差异，采用SIM模式，分3个时间段(6～12 min、12～16 min、16～24 min)扫描，分别对化合物选择1个定量和定性离子进行分析，图3为标准品和牦牛酥油样品中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯在SIM模式下的总离子流色谱图。

A-标准品；B-样品；1-戊酸乙酯(内标)； 2-乳酸乙酯；3-辛酸乙酯；4-癸酸乙酯图3 标准品和牦牛酥油样品SIM扫描离子流色谱图Fig.3 The SIM chromatogram of standard and yak butter sample

用二氯甲烷同时蒸馏萃取处理牦牛酥油后，采用内标法定量分析，各样品中乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯含量见表7。

表7 牦牛酥油特征挥发性物质含量Table 7 The content of characteristic volatile compounds in yak butter

可以看出，牦牛酥油中乳酸乙酯含量范围在0.54～5.14 mg/kg；辛酸乙酯含量范围在0.28～2.20 mg/kg；癸酸乙酯含量范围在0.34～3.84 mg/kg，这与牦牛乳发酵制作酥油的特殊工艺和发酵时间的控制相关。

4 结论

利用同时蒸馏萃取结合气质联用分析对牦牛酥油进行分析，发现牦牛酥油中共鉴定出65种挥发性物质，其中酸类19种，酯类12种，烷类11种，酮类10种，醇类5种，醛类1种，其他类6种；其他类奶油样品中共鉴定出41种挥发性物质，其中酸类9种，酯类8种，烷类4种，酮类10种，醇类1种，醛类3种，其他类5种。牦牛酥油样品挥发性物质含量高于其他奶制品，且含有乳酸乙酯、辛酸乙酯和癸酸乙酯这3种酯类，这些特征性酯类物质在其他8种外形相似的奶制品中都未检测到。作为牦牛酥油中含量较为丰富的特征挥发性物质，乳酸乙酯味道浓厚，苦涩微甜；辛酸乙酯味甜，具有梨香、菠萝的香味；而癸酸乙酯具有白兰地醇香[24-31]。

对牦牛酥油复杂基质中这3种特征酯类物质，采用同时蒸馏萃取结合气质联用的方法进行定量分析，建立了内标定量分析方法，线性相关系数R2≥0.997，线性范围1.0～50.0 μg/mL；乳酸乙酯检出限0.13 μg/kg、回收率86.7 %～104.7%；辛酸乙酯检出限0.18 μg/kg、回收率89.3 %～105.7%；癸酸乙酯检出限0.17 μg/kg、回收率83.3%～89.5%；相对标准偏差RSD值<2.1%。方法具有较好的线性,灵敏度、准确性较高，可应用在牦牛酥油中乳酸乙酯、辛酸乙酯、癸酸乙酯特征挥发性成分分析中。本检测方法具有操作简单、试剂耗用量少、去除复杂样品基质干扰效果明显等优点。测定6种牦牛酥油样品，乳酸乙酯含量范围在0.54～5.14 mg/kg，辛酸乙酯范围在0.28～2.20 mg/kg，癸酸乙酯范围在0.34～3.84 mg/kg。牦牛酥油与其他奶制品间挥发性物质种类与含量存在较明显的差异，该方法可为区分牦牛酥油与其他相似奶制品、以及评价不同酥油间的风味品质、改善加工工艺提供参考方法。