荞麦皮多糖组成及其抗氧化特性分析

2019-07-24刘瑶王新然赵悦李林强

食品与发酵工业 2019年13期

刘瑶，王新然，赵悦，李林强

(陕西师范大学食品工程与营养科学学院，陕西西安,710119)

多糖是由多个单糖分子脱水缩合形成的高分子碳水化合物，是构成动植物细胞壁的主要成分[1]。现有研究表明多糖能够增强免疫、抗肿瘤、降血脂、降血糖、抗病毒、抗炎、抗氧化等[2-4]。其中关于抗氧化的研究较多，一直是多糖功能的研究热点。在正常情况下，机体内的氧化系统和抗氧化系统处于动态平衡的状态，自由基的产生和清除也处于动态平衡，但当这个2平衡被打破之后，机体会产生过量自由基，对自身造成损伤，添加外源性抗氧化剂可以清除自由基达到抗氧化的目的，但人工合成的抗氧化剂存在着潜在危险，而多糖可作为一种天然的抗氧化剂替代合成的抗氧化剂[5-6]。

荞麦属于蓼科，是中国传统保健食品之一，常用来做饸饹、凉粉、面包、糕点等食品，以预防高血脂、高血糖、高血压等。荞麦多糖是其主要功能成分之一，国内对其研究较多。李飞等[7]优化了荞麦多糖的提取工艺；谷仿丽等[8]研究表明适当剂量的金荞麦多糖可增强免疫；WU等[9]研究表明荞麦多糖能有效促进白血病细胞的分化和成熟；赖云等[10]报道了荞麦多糖能够抑制小鼠自发性活动并延长其睡眠时间；曾靖等[11]报道了荞麦多糖对肝有保护作用；较多研究表明荞麦多糖具有抗氧化作用[12-13]，而抗氧化又与多糖的组成和结构有关[4]。

荞麦皮是荞麦粉加工副产品，目前对荞麦皮的研究多集中于酚类[14]、膳食纤维[15]、色素[16]等的研究，荞麦皮多糖的研究鲜有报道，荞麦皮多糖是否具有与荞麦粉多糖相似的保健功能还不明确。本研究以荞麦皮为研究对象，对荞麦皮多糖进行分离和提取，通过对其组成成分及抗氧化特性的分析，为荞麦皮多糖的研究提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

荞麦皮，当地农贸市场。DPPH、甲醇，美国Sigma公司；乙腈，德国Merck公司；1-苯基-3-甲基-5-吡唑啉酮(PMP)、葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸，阿拉伯糖，上海源叶生物科技有限公司；DEAE-52纤维素、苯酚、乙醇、H2SO4、NaOH、氯仿、正丁醇、TFA、铁氰化钾、三氯乙酸、过氧化氢、邻苯三酚等，均为国产分析纯试剂。

1.2 仪器与设备

磁力搅拌恒温槽(HXC-500-6A)，北京惠诚佳仪科技有限公司；傅里叶变换红外光谱仪(vertex 70)，Bruker公司；光学显微镜(TYPE120M)，Motic公司；高效液相色谱仪，Thermo公司；C18柱(250 mm×4.6 mm)，Agilent；紫外可见分光光度计，上海仪电分析有限公司。

1.3 方法

1.3.1 荞麦皮多糖的提取及粗多糖提取率的测定

多糖的制备：将荞麦皮粉碎，以料液比1∶10(g∶mL)在50、60、70、80、90 ℃磁力搅拌恒温水槽中分别处理2 h，过滤弃渣，400×g离心10 min，合并上清液。减压浓缩后，采用Sevage法[17]脱蛋白，取上清液加入乙醇，在4 ℃条件下过夜，离心后弃上清液，真空冷冻干燥后，得到荞麦皮粗多糖。称取粗多糖100 mg溶于2 mL蒸馏水中，采用DEAE-52 纤维素柱层析分离法，依次用蒸馏水、0.5、1.0 mol/L NaCl进行洗脱，收集洗脱液、透析、真空冷冻干燥，得到纯度较高的荞麦皮多糖，备用。

荞麦皮粗多糖含量=荞麦皮中总糖含量-其还原糖含量[18]，其中荞麦皮总糖含量的测定采用苯酚硫酸法[19]，以葡萄糖质量浓度为横坐标，吸光度为纵坐标，绘制标准曲线(y=1.460 7x+0.360 4，R2=0.951)。分别吸取经50、60、70、80、90 ℃处理后的荞麦皮提取液1.0 mL，测定吸光度，根据标准曲线方程计算总糖含量，同时测定此荞麦皮提取液中还原糖的含量(采用1.3.2中方法)，荞麦皮粗多糖提取率的计算如公式(1)所示：

(1)

式中：Y,荞麦皮粗多糖提取率，%；A,荞麦皮总糖含量，mg；B,还原糖含量，mL；M,荞麦皮质量，mg

1.3.2 荞麦皮提取液中还原糖含量的测定

还原糖含量的测定采用3,5-二硝基水杨酸法。参考文献[20]的方法，做部分修改。分别取葡萄糖标准溶液(1 mg/mL) 0、0. 1、0. 2、0. 3、0. 4、0. 5 mL于试管中，用蒸馏水定容至0.5 mL，加0.5 mL DNS试剂混匀，在沸水浴中加热5 min，冷却至室温，再加入蒸馏水8 mL，混匀，于520 nm波长处测定各待测液的吸光度值，以葡萄糖含量为横坐标(0.1、0.2、0.3、0.4、0.5 mg)，吸光度为纵坐标绘制标准曲线(y=1.668 9x+0.033，R2=0.995)。分别吸取经50、60、70、80、90 ℃处理后的荞麦皮提取液0.5 mL于试管中，测定吸光值。通过标准曲线计算荞麦皮提取液中还原糖的含量，并计算出其所占总糖含量的百分比。

1.3.3 荞麦皮多糖的红外光谱分析

取KBr于110 ℃烘箱中干燥2 h，将干燥后的KBr与经不同温度提取后的荞麦皮多糖分别以100∶1的比例研磨混合，在压片机中压制成透明薄片，再放置于傅里叶变换红外光谱仪(fourier transform infrared spectrum，FTIR)中进行扫描检测，扫描波数范围为4 000～400 cm-1，使用Origin 8.0 软件进行数据分析。

1.3.4 乙醇体积分数对荞麦皮粗多糖沉淀量的影响

参考文献[21]的方法，取离心管标号、称重并记录，吸取荞麦皮提取液0.4、0.8、1.2、1.6、2.0 mL于离心管中，加入无水乙醇定容至8.0 mL，此时乙醇体积分数分别为95%、90%、85%、90%、75%。2～4 ℃条件下过夜，400×g离心10 min，弃上清后放置在天平上称重，计算差值即为粗多糖沉淀量。

1.3.5 荞麦皮多糖的显微镜观察及紫外吸收特征峰分析

将荞麦皮多糖用蒸馏水配成悬浊液(1 mg/mL)，制片，用光学显微镜观察荞麦皮多糖的形貌特征，以荞麦淀粉为对照。并用紫外光谱分析多糖溶液在190～400 nm处的特征峰，观察260、280 nm处是否存在特征吸收峰，以检测是否含有蛋白质和核酸[22]。

1.3.6 荞麦皮多糖单糖组成成分分析

参考文献[23-25]的方法，做部分修改。分别取标准品葡萄糖、甘露糖、半乳糖、核糖、木糖、鼠李糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸、阿拉伯糖各1 mg，精密称量，用蒸馏水配制成1 mg/mL的溶液。

取单糖标准品200 μL于试管中，加入200 μL 0.5 mol/L PMP甲醇溶液及200 μL 0.3 mol/L NaOH溶液，超声混合后在70 ℃水浴中反应30 min，冷却后加200 μL 0.3 mol/L HCl溶液中和反应，再加氯仿萃取3次，合并水层，之后用0.22 μm微孔膜过滤，用HPLC进行分析。

称取荞麦皮多糖样品5 mg于顶空瓶中，加入2 mL 4 mol/L TFA，充氮气封管，置110 ℃烘箱中烘8 h，多糖经酸水解成单糖。冷却至室温，反应混合物经400×g离心10 min后取上清液并用滤纸过滤，用NaOH溶液中和到pH值约7.0。再按上述方法衍生化，让单糖与PMP试剂反应形成稳定的衍生物，此产物在250 nm处有强烈的紫外吸收，再进行HPLC分析。HPLC测试条件：采用C18柱(250 mm×4.6 mm)；柱温30 ℃；流速1.0 mL/min；波长250 nm；流动相乙腈-0.05 mol/L磷酸缓冲液。

1.3.7 荞麦皮多糖的抗氧化特性分析

(1)铁氰化钾还原力测定：参考文献[26-27]的方法，部分修改，取1 mL不同浓度的荞麦皮多糖溶液于试管中，加入0.2 mol/L pH值6.6磷酸盐缓冲溶液和质量分数为1%铁氰化钾溶液各2.5 mL，混匀，在50 ℃条件下水浴20 min，冷却后加入2.5 mL质量分数为10%三氯乙酸溶液，取混合液2.5 mL，加入2.5 mL蒸馏水和0.5 mL质量分数为0.1%三氯化铁溶液，混匀，在700 nm波长处测定吸光度。

(2)DPPH自由基清除能力测定：参考文献[28-29]的方法，稍作改进。称取3 mg DPPH溶于60 mL无水乙醇中，再取2 mL DPPH溶液于试管中，加入多糖溶液，当DPPH溶液颜色完全褪去时，以此时所加样品量定义为最大用量，再向前等差递减4个样品量。在测试中，当加样量达到50 μL时，DPPH溶液颜色褪去，向前等差递减取50、40、30、20 μL四个加样量。取2 mL DPPH溶液于试管中，加入多糖溶液xμL，再加入(1 000-x)μL蒸馏水至溶液体积为3 mL，避光静置30 min，在519 nm处测定其吸光度A。用蒸馏水代替样品，测定其吸光度A0。DPPH自由基清除能力可用公式(2)表示。

(2)

式中：Y，DPPH自由基清除率，%；A0，蒸馏水代替样品的吸光度；A，样品的吸光度值。

(3)羟基自由基清除能力测定：参考文献[30-31]的方法采用水杨酸法。取2 mL多糖溶液于试管中，依次加入2 mL 6 mmol/L FeSO4、2 mL 6 mmol/L水杨酸-乙醇溶液、2 mL 6 mmol/L H2O2溶液，37 ℃反应30 min后，在波长510 nm处测定吸光度。羟基自由基清除能力用公式(3)表示：

(3)

式中：Y，羟基自由基清除率，%；A，样品吸光度值；A1，以蒸馏水代替样品的对照吸光度；A0，以蒸馏水代替样品和H2O2的吸光度。

1.4 数据处理

2 结果与讨论

2.1 温度对荞麦皮粗多糖提取率及还原糖含量的影响

采用不同温度提取荞麦皮多糖，得到的结果如图1所示。随着提取温度的升高，荞麦皮粗多糖提取质量百分数显著升高(P<0.05)。经80 ℃提取的粗多糖质量百分数为5.61%，显著高于其他各组的提取(P<0.05)，但与90 ℃无显著性差异(P>0.05)，故选用80 ℃为提取荞麦皮多糖的最佳温度。杨淑芳[32]做了荞麦麸皮粗多糖提取温度的筛选，也得到了相似的结果。荞麦皮总糖中还原糖的含量随着温度的升高显著下降(P<0.05)，温度为50 ℃时还原糖含量最高，这与酶的作用有关，植物中，酶发挥作用的最适温度一般在40～50℃左右，所以随着提取温度的升高酶活性有所降低，还原糖含量也随之降低。

图1 温度对荞麦皮多糖得率及还原糖含量的影响Fig.1 Effect of temperature on buckwheat husk polysaccharides yield and reducing sugar content

2.2 荞麦皮多糖的红外光谱分析结果

不同温度提取的荞麦皮粗多糖的傅里叶红外光谱结果如图2所示。5组经不同温度提取的荞麦皮多糖的红外图谱整体趋势基本相似。

a-e分别为90、80、70、60、50 ℃图2 不同温度提取的荞麦皮多糖的傅里叶红外光谱图Fig.2 Original FTIR spectra of buckwheat husk polysaccharides extracted at different temperatures

如图2所示，在3 359 cm-1左右出现的强吸收峰是O—H伸缩振动，在3 000～2 800 cm-1出现的3组吸收峰是C—H伸缩振动[33]，这都是糖类化合物的特征吸收峰。1 606 cm-1处的强吸收峰是由羰基伸缩振动引起的[34]。1 236、1 396 cm-1出现的吸收峰是C—H变角振动[35]。1 100～1 010 cm-1出现3个吸收峰验证了此多糖属于吡喃糖[36]。829、894 cm-1处有弱吸收峰，表明此多糖中既含有α型糖苷键，又含有β型糖苷键[37]。经不同温度提取的5组多糖局部峰面积、峰强度有差异但很微小，表明温度几乎不会影响荞麦皮多糖的官能团结构。

2.3 乙醇体积分数对荞麦皮水提液粗多糖沉淀量的影响

图3结果表明，随着乙醇体积分数的升高，多糖沉淀量显著上升(P<0.05)。这是由于乙醇会破坏多糖的氢键，从而导致其在水中的溶解度降低，形成沉淀析出[38]。当乙醇体积分数达到95%时，多糖沉淀量为0.29 g，显著高于其他各组(P<0.05)。结果表明，在醇沉过程中，乙醇的体积分数越大越有利于多糖的沉淀。

不同小写字母表示差异显著(P<0.05)图3 乙醇体积分数对粗多糖沉淀量的影响Fig.3 Effect of alcohol volume concentration on crude polysaccharide precipitation qualities

2.4 荞麦皮多糖与荞麦淀粉形貌特征的比较及紫外光谱分析结果

光学显微镜可清晰的观察到多糖的形貌特征，图4为放大400倍后观察到的现象，可见多糖分子是絮状、链状结构(图4-A)，淀粉颗粒呈现圆形或椭圆形的环状结构(图4-B)，甚至可见脐点，具有常见淀粉的典型特征[39]。通过观察，多糖的分子结构与淀粉截然不同，且多糖中并未发现类似淀粉结构，结果表明所得的荞麦皮多糖不含淀粉。

A-荞麦多糖; B-荞麦淀粉(放大倍数400×)图4 荞麦皮多糖与荞麦淀粉光学显微镜图Fig.4 Microscopy images of buckwheat husk polysaccharides and starch of buckwheat

荞麦皮多糖在190～400 nm的紫外扫描结果如图5所示。由图可知，多糖在192 nm处出现了强烈的特征吸收峰，且在260 nm和280 nm处未出现吸收峰，结果证明所得多糖中不含蛋白质和核酸。

图5 荞麦皮多糖的紫外光谱图Fig.5 Analyze buckwheat husk polysaccharides on UV spectrum

2.5 荞麦皮多糖的单糖组成分析结果

经过HPLC分析后，荞麦皮多糖的单糖组成分析结果如图6可知，各色谱峰分离度良好，图中最高峰为溶液中残留的PMP试剂。荞麦皮多糖主要由甘露糖、核糖、葡萄糖醛酸、葡萄糖、半乳糖、阿拉伯糖组成，其相对质量百分数分别为6.47%、1.18%、9.66%、52.63%、17.26%、12.8%。与颜军等[40]和赵亮[18]研究的荞麦粉多糖的单糖组成相比，两者都含有葡萄糖、半乳糖、甘露糖、阿拉伯糖，不同的是荞麦粉多糖还含有鼠李糖，这种差异的产生，可能是因为品种、产地等的不同。上述结果表明荞麦皮多糖的单糖组成与荞麦粉多糖存在差异。

峰1-甘露糖;峰2-核糖；峰3-葡萄糖醛酸；峰4-葡萄糖；峰5-半乳糖；峰6-阿拉伯糖图6 荞麦皮多糖组成HPLC分析Fig.6 Analyze buckwheat husk polysaccharides compositions on HPLC

2.6 荞麦皮多糖的抗氧化结果

如图7-A所示，随着多糖浓度的升高，其铁氰化钾还原能力显著增强(P<0.05)，铁氰化钾还原能力越强，抗氧化效果越好。荞麦皮多糖对羟基自由基的清除能力随着其质量浓度的增大呈上升趋势(图7-B)。在多糖质量浓度达到0.20 mg/mL时，清除率最高，为10%，但低于VC，一方面可能是由于试验设定的样品浓度过低，这有待进一步完善；另一方面，在加热提取多糖时，高温使多糖的结构发生改变，进而使其抗氧化效果降低[41]。随着多糖浓度的增大，其对DPPH自由基的清除能力显著上升(P<0.05)(图7-C)。当浓度为27.20 μg/mL时，多糖对DPPH自由基的清除率为68%，显著大于其他各组浓度(P<0.05)。对照组VC的铁氰化钾还原能力和自由基清除能力均大于样品。以上结果表明，荞麦皮多糖具有良好的抗氧化效果且具有浓度依赖性，但其抗氧化效果弱于VC。