肖岚，何佩云，谢巧，杜昕，李诚*

1(四川农业大学 食品学院，四川 雅安，625014) 2(四川旅游学院 食品学院，四川 成都，610100)

通过酶解联合发酵制备的肽粗提液的成分复杂，要实现有效的分离纯化相对困难。目前，生物活性肽分离纯化的主要手段包括超滤[1-2]、凝胶层析[3-4]、离子交换层析[5]、色谱[6-8]等，为实现纯化目的，普遍采用多种分离手段联用的方式。本研究的前期实验以体外抗氧化指标作为评价体系，采用枯草芽孢杆菌(SICC1.197)联合碱性蛋白酶制备出牦牛血抗氧化低聚肽，利用超滤离心将牦牛血低聚肽分离为分子量>10 kDa、5～10 kDa、<5 kDa三个组分，利用Sephadex G-25凝胶层析法对分子量<5 kDa的组分进一步分离得到4个组分，其中组分Ⅰ的·OH清除能力最高，IC50值为0.72 mg/mL[9]。本实验通过测定组分Ⅰ的分子量分布发现其肽段主要分布在分子量<1 kDa范围内，而超滤拥有无相变、能耗低、节约试剂、设备简单等优点，并且能够实现连续化分离并能缩短生产周期[10-12]。因此，本实验拟采用<1 kDa超滤离心代替凝胶层析制备牦牛血抗氧化低聚肽，并对其体外抗氧化活性进行研究，以期获得更简便有效的牦牛血抗氧化低聚肽制备工艺。

缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化供能，最终会导致机体的心、脑等主要器官缺氧供能不足而死亡[13]。生物体在长期的进化过程中已形成了一套从环境中有效获取氧的能力，然而机体对缺氧的适应能力是有限的，特别是严重缺氧以及急性严重缺氧时，机体往往来不及发挥适应机制便进入代谢障碍阶段。因此采用一些抗缺氧保健食品(药物)来改善机体抗缺氧能力是非常重要的。牦牛是散布在海拔3 000 m以上的特殊家畜，经过世代的自然选择，牦牛显示出对低氧环境极好的适应性，这可能与牦牛血液的特殊性有一定关系[14-16]。姚星辰等[17]报道牦牛活性蛋白具有显著的延长抗缺氧时间的作用；李冬利等[18]报道黄牛血活性肽能显著延长小鼠在常压缺氧和特异性心肌缺氧条件下的存活时间。实验组前期研究已证实，牦牛血低聚肽具有较好的抗氧化活性，而关于其新的适应症——抗缺氧活性的相关报道在国内外比较鲜见。因此，本实验拟对牦牛血抗氧化低聚肽的抗缺氧活性进行初探，为进一步开发利用牦牛血低聚肽奠定实验基础。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

牦牛血，四川省大渡河食品有限公司；蛋白酶K，德国MERCK公司；碱性蛋白酶(酶活力为85.61 U/mg)，上海Kayon公司；枯草芽孢杆菌SICC1.197，四川省微生物资源平台菌种保藏中心；大豆低聚肽(分子量<1 kDa)，西安百川生物科技有限公司，样品外观为浅黄色粉末，蛋白质含量84.17%，其氨基酸组分见表1；红景天胶囊(国食健字G20100243，规格为 400 mg/粒，每100 g含红景天苷0.5 g)，北京同仁堂健康药业股份有限公司；其他化学试剂均为国产分析纯。

表1 大豆低聚肽的氨基酸含量Table 1 Amino acid content of soybean oligopeptides

1.2 仪器与设备

超滤管(<5 kDa)，德国Sartorius公司；超滤管(<1 kDa),美国Pall公司；H2050R台式高速冷冻离心机,长沙湘仪离心机有限公司；QYC-2102C恒温振荡培养箱,上海福玛实验设备有限公司；UV Power紫外可见分光光度计,北京莱伯泰科仪器有限公司；移液枪,德国Brand公司；LGJ-50F冷冻干燥机,北京松源华兴科技发展有限公司；A300自动氨基酸分析仪,德国曼默博尔公司；Mission血红蛋白分析仪,艾康生物技术(杭州)有限公司。

1.3 方法

1.3.1 牦牛血抗氧化低聚肽的制备及指标测定

1.3.1.1 培养基的配制与菌液制备

将枯草芽孢杆菌于活化培养基活化后，接种于种子培养基，35 ℃、135 r/min恒温振荡培养12 h，得到实验用菌液(1×109/mL)，培养基配制参数如表2。

表2 培养基的配制 单位：g/L

1.3.1.2 菌酶联合制备牦牛血抗氧化低聚肽

采用实验组前期研究的菌酶联合法[19-20]制备牦牛血抗氧化低聚肽。

将1.3.1.1制备的菌液以接种量2.5%(V/V)加入底物质量浓度为75 g/L的高压灭菌(121 ℃，15 min)的牦牛血液中，经35 ℃、135 r/min、72 h恒温振荡培养，发酵结束后经高压灭菌(121 ℃，15 min)，得到牦牛血发酵液。牦牛血发酵液冷却后加入碱性蛋白酶，在酶底比190 U/g、pH 9.5、60 ℃、3 h的条件下进行酶解，酶解结束后经沸水水浴灭酶活10 min，得到牦牛血酶解液。将牦牛血酶解液在4 ℃条件下，6 000 r/min离心15 min，取上清液用0.45 μm滤膜抽滤去除菌体残渣，再将滤液用5 kDa超滤管于4 ℃条件下，4 000 r/min离心10 min后取上清液得到分子量<5 kDa牦牛血低聚肽；肽液用1 kDa超滤管于4 ℃条件下，4 000 r/min离心30 min后得到分子量 <1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽。

1.3.1.3 分子量分布的测定

样品经0.2 mol/L NaNO3溶液稀释后，过0.22 μm滤膜、超声波脱气15 min后定容，采用ELEOS System凝胶色谱仪，设定流速0.5 mL/min、柱温20 ℃，运行ARTRAV软件后过膜上机，取基线、定峰后分析可得GPC分子质量分布图。

1.3.1.4 氨基酸组分的分析

采用A300自动氨基酸分析仪分析得氨基酸组分分析谱图。

1.3.2 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的分析

1.3.2.1 体外抗氧化指标的测定

·OH清除率测定参照TIAN F等[21]的方法、抑制脂质过氧化能力参照CHEN NAIFU等[22]方法、还原力测定参照刘昭明等[23]的方法、ABTS+·清除率测定参照潘瑶等[24]的方法、DPPH·清除率测定参照朱夕波等[25]的方法、总抗氧化力测定参照YANG M等[26]的方法。半抑制浓度( IC50) 值的测定参考杜昕等[19-20]的方法。

1.3.2.2 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的验证

采用蒸馏水代替牦牛血，其他步骤同 1.3.1.2，制备发酵液、酶解液以及<1 kDa低聚肽，分别测定其·OH清除率。按照 1.3.1.1 的方法制备枯草芽孢杆菌菌液；按照酶底比190 U/g将碱性蛋白酶溶解在蒸馏水中；将75 g牦牛血液溶解在1 L蒸馏水，分别测定其·OH清除率。

1.3.2.3 蛋白酶K验证实验

分别将分子量<1 kDa 的牦牛血抗氧化肽冻干粉以及分子量<5 kDa的牦牛血抗氧化肽冻干粉配制成质量浓度为5 mg/mL的溶液，加入质量浓度100 μg/mL的蛋白酶K溶液，混匀后置于55 ℃下恒温水浴2 h后，测定其·OH清除率，以探讨牦牛血抗氧化低聚肽的肽段所发挥的抗氧化活性。

1.3.3 牦牛血抗氧化低聚肽耐缺氧活性的初探

SPF级KM小鼠，雄性，体质量18～22 g，购自成都达硕实验动物中心，动物合格证号: SCXK(川)2015-030。将小鼠随机分为5组，即空白对照组(等体积的生理盐水)、红景天阳性药物组以及牦牛血低聚肽低、中、高剂量组(365、700、1 500 mg/kg )。灌胃30 d，1 次/d，自由摄食和饮水，灌胃后观察小鼠的精神状态、活动、觅食量等指标。

根据《保健食品检验与评价技术规范(2003版)》中“功能学评价程序与检验方法”进行常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验。受试样品组与对照组比较，存活时间延长，并具有统计学意义，则判定该实验结果阳性。

小鼠Hb含量测定：自每只小鼠眼眶内眦静脉丛采血，采用Mission 血红蛋白分析仪检测全血Hb含量。按Mission血红蛋白分析仪说明书进行操作。

随着电气企业不断加强对电气自动化技术的优化升级，促使电气自动化控制设备越来越被广泛应用。当前大部分设备元器件生产企业在实际生产当中，由于缺乏严格的标准制度，并且这部分生产企业规模相对较小，在技术方面、生产经验方面等严重不足，导致其生产出来的元器件价格相对较低。但是，这部分厂家所生产出来的元件质量方面没有达标，不符合相关的质量标准要求，如果将该部分不合格的元件投入实际的生产当中，则必然会给电气自动化设备造成严重的影响，并且对操作人员的人身安全造成威胁。

红景天用量参照人用量(每日2次，每次3粒)进行换算，用蒸馏水溶解红景天颗粒，配成质量浓度36.4 mg/mL的灌胃液，按10 mL/kg BW灌胃；对照组以蒸馏水灌胃。

1.4 数据处理

试验数据经3次平行试验后得到，通过方差分析(ANOVA)来检测数据之间的差异性。统计分析使用Excel 2013、SPSS 16.0、Origin 8.1等软件。

2 结果与分析

2.1 分子量分布

本实验对峰Ⅰ组分进行分子量分布的检测，结果如图1和表3所示， 78.97%的肽段分布在<1 kDa的分子量段，这与文献报道的绝大部分具有生理活性的肽段分子质量较小[27-29]相吻合。为了简化牦牛血抗氧化低聚肽的制备工艺、方便大量制备，本实验采用超滤分级的方法制备分子量<1 kDa的牦牛血抗氧化低聚肽。

表3 组分Ⅰ的分子量分布Table 3 Molecular weight distribution of one component

2.2 牦牛血抗氧化低聚肽的氨基酸组成

对超滤分级得到的分子量<1 kDa的牦牛血抗氧化低聚肽进行氨基酸组分分析，结果见表4。分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽的氨基酸组成较为丰富，由13种氨基酸构成，氨基酸含量为85.25 g/100g。研究表明，大部分抗氧化肽在N端包含疏水性氨基酸如Val或Leu，并且序列中含有Pro、His[30]、Tyr、Trp[31]和Cys[32]等氨基酸。牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性可能与高含量的Leu、Pro以及Tyr有关。当然，除了氨基酸组成会影响抗氧化活性，肽段序列、一级结构以及活性位点也会影响其抗氧化活性[33]。

2.3 牦牛血抗氧化低聚肽体外抗氧化活性的分析

2.3.1 不同牦牛血抗氧化低聚肽对·OH的IC50值

由表5可知，超滤分级得到的分子量<1 kDa 牦牛血抗氧化低聚肽对·OH的IC50值为0.76 mg/mL,极显著高于分子量< 5 kDa牦牛血低聚肽(P<0.01)。比Sephadex G-25分离纯化得到的峰Ⅰ组分的·OH清除能力略差，但差异不显著(P>0.05)，其清除·OH的IC50值为0.72 mg/mL。因此，采用超滤分级制备分子量<1 kDa 牦牛血抗氧化低聚肽是可行的。

表4 分子质量<1 kDa牦牛血低聚肽的氨基酸组成Table 4 Amino acid composition of yak blood oligopeptides with molecular weight less than 1 kDa

表5 不同牦牛血低聚肽对·OH的IC50值的比较Table 5 Comparison of IC50values of different yak blood oligopeptides on ·OH

2.3.2 分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽的体外抗氧化活性

牦牛血抗氧化低聚肽和大豆低聚肽体外抗氧化活性的 IC50值见表6。由表6可知，牦牛血抗氧化低聚肽的总抗氧化能力极显著优于大豆低聚肽(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽的还原能力与大豆低聚肽差异不显著(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽对脂质过氧化抑制能力、对·OH自由基的清除能力极显著优于大豆低聚肽(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽对 DPPH· 的清除能力极显著优于大豆低聚肽(P<0.01)；但是，牦牛血抗氧化低聚肽对 ABTS+· 的清除能力却低于大豆低聚肽(P>0.05)。以上数据说明，本实验制备的牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性优于商品化的大豆低聚肽，牦牛血抗氧化低聚肽具有作为天然抗氧化剂开发的潜力。

表6 两种低聚肽体外抗氧化活性的IC50值Table 6 IC50 value of antioxidant activity of two oligopeptides in vitro

注：与大豆低聚肽相比，*P<0.05，**P<0.01。

2.3.3 牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的验证分析

图1-A是碱性蛋白酶液、枯草芽孢杆菌液以及牦牛血对·OH的清除率。牦牛血的·OH清除率为19.14%，可能与血液本身含有抗氧化成分[14-16]有关；而碱性蛋白酶液和枯草芽孢杆菌液的·OH清除率较低，分别为8.57%和9.53%。此结果提示，碱性蛋白酶、枯草芽孢杆菌以及牦牛血本身的·OH的清除能力较弱。

图1 制备工艺对牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的影响Fig.1 Effect of preparation process on antioxidant activity of yak blood antioxidant oligopeptides

如图1-B所示，用蒸馏水代替牦牛血进行发酵、酶解以及<1 kDa超滤分级，得到的发酵液、酶解液、超滤液对·OH清除率分别为6.21%、9.59%、1.14%，而牦牛血的发酵液、酶解液以及<1 kDa 超滤液对·OH清除率分别为74.48%、93.62%、97.27%，差异极显著(P<0.01)，实验结果说明牦牛血蛋白质在发酵、酶解过程中形成的寡肽以及低聚肽贡献了牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性。

为了进一步验证牦牛血抗氧化低聚肽的肽段是其抗氧化活性的主要来源，实验采用蛋白酶K对分子量<5 kDa和分子量<1 kDa 的牦牛血抗氧化低聚肽进行彻底水解，结果见图1-C。分子量<5 kDa牦牛血抗氧化低聚肽(5 mg/mL)经蛋白酶K水解后对·OH清除率由95.89%下降到25.55%(P<0.01)，而分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽(5 mg/mL)经蛋白酶K水解后对·OH清除率由97.27%下降到24.23%(P<0.01)，可能是由于蛋白酶K水解低聚肽形成了较多的游离氨基酸，从而导致低聚肽对·OH清除能力的显著下降。

综上，牦牛血蛋白质经过枯草芽孢杆菌发酵以及碱性蛋白酶水解后得到的肽段是牦牛血抗氧化低聚肽抗氧化活性的主要来源，而枯草芽孢杆菌、碱性蛋白酶对牦牛血抗氧化低聚肽的抗氧化活性影响较小。

2.4 分子量<1 kDa牦牛血抗氧化低聚肽抗缺氧活性的初探

对照组、阳性对照组(红景天组)、牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低剂量组小鼠的体重变化见表7。表7显示，小鼠适应性喂养一周后进行分组时的体重差异不存在统计学意义(P>0.05)，说明灌胃前的实验小鼠的体重几乎一致；灌胃30 d后，5组小鼠均较分组时的体重有不同幅度的提高，但是红景天组和牦牛血抗氧化低聚肽高中低剂量组的小鼠体重增加幅度均低于对照组，特别是牦牛血抗氧化低聚肽高剂量组小鼠体重与对照组差异显著(P<0.05)。可能是因为牦牛血抗氧化低聚肽具有苦味，剂量越大,苦味越重从而影响小鼠的自由摄食。如果开发保健食品或功能食品配料，建议可以采用微胶囊包埋技术解决牦牛血抗氧化低聚肽苦味的问题。

表7 牦牛血抗氧化低聚肽对小鼠体重的影响Table 7 Effect of yak blood antioxidant Oligopeptide on body weight of mice

注：与对照组相比，#P<0.05，##P<0.01；与红景天组相比，*P<0.05，**P<0.01。下同。

由表8可知，对照组、红景天组、牦牛血抗氧化低聚肽高中低剂量组小鼠灌胃30 d后空腹的血红蛋白含量差异均不显著(P>0.05)。经常压耐缺氧实验后，自每只小鼠眼眶内眦静脉丛采血测定血红蛋白含量，结果发现，阳性对照组(红景天组)、牦牛血中剂量组与对照组差异显著(P<0.05)；牦牛血低聚肽低剂量组与对照组差异不显著(P>0.05)，高剂量组与对照组差异极显著(P<0.01)；牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低剂量组与阳性对照组(红景天组)差异不显著。此结果提示，在缺氧条件下牦牛血抗氧化低聚肽中、高剂量组具有明显的提高小鼠全血血红蛋白含量的作用。

表8 牦牛血抗氧化低聚肽对小鼠Hb的影响 单位：g/L

缺氧对机体是一种紧张性刺激，影响机体各种代谢，特别是影响机体的氧化功能，最终会导致机体的心、脑等主要器官功能不足而死亡。牦牛血抗氧化低聚肽在常压密闭缺氧过程中显示了较高的抗缺氧活性，见表9。

表9 牦牛血抗氧化低聚肽对小鼠常压缺氧存活时间的影响Table 9 Effects of yak blood antioxidative oligopeptides on the survival time of mice under normal pressure hypoxia

注：延长率=(药物组存活时间-对照组存活时间)/对照组存活时间。下同。

与对照组比较，阳性对照组、牦牛血抗氧化低聚肽中、低剂量组虽然均能够延长小鼠的存活时间，但无显著性差异(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽高剂量组能显著延长常压缺氧小鼠的存活时间(P<0.05)；与阳性对照组比较，延长率达到了23.5%，差异极显著(P<0.01)。

亚硝酸钠使正常二价铁血红蛋白转变成三价铁血红蛋白，破坏血红蛋白携氧能力，造成组织缺氧死亡。与对照组比较，红景天阳性对照组虽然能够延长小鼠的存活时间，但是无显著性差异(P>0.05)；牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低剂量组均能延长缺氧小鼠的存活时间，高、中剂量组的小鼠存活时间延长率极显著高于阳性对照组(P<0.01)。结果见表10。

表10 牦牛血抗氧化低聚肽对小鼠亚硝酸钠中毒存活时间的影响Table 10 Effects of yak blood antioxidative oligopeptides on the survival time of sodium nitrite poisoning in mice

常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验的结果与对照组比较，存活时间延长并具有统计学意义，则可判定该实验结果阳性，即适当剂量的牦牛血抗氧化低聚肽具有提高小鼠缺氧耐受力的作用。

3 讨论与结论

1 kDa 超滤分级制备的牦牛血抗氧化低聚肽是1个低聚肽的混合物，其·OH清除能力、DPPH·清除能力、总抗氧化力以及脂质过氧化抑制能力均极显著优于商品化大豆肽(P<0.01)。因此，菌酶发酵结合超滤分级制备牦牛血抗氧化低聚肽是可行的，且牦牛血抗氧化低聚肽可作为一种天然抗氧化剂做进一步的体内实验研究。

缺氧会诱导机体氧敏感性途径活化，催化线粒体通过Fenton反应和Haber-Weiss反应生成自由基[34]，影响机体正常的氧化分解供能作用。SCHREIBER等[35]发现维生素E和维生素C的自由基清除作用可以延长急性缺氧小鼠的存活时间。AL-HASHEM[36]发现补充维生素E和维生素C可以对抗高原缺氧引起的大鼠肺损伤。樊鹏程等[37]首次证实咪唑啉类自由基清除剂具有抗高原缺氧作用，其机制为清除减压缺氧导致的体内过量ROS等自由基产生，即缺氧损伤的发生和线粒体内自由基释放增加密切相关[38]。牦牛血抗氧化低聚肽具有良好的体外抗氧化活性，因此本实验通过常压耐缺氧实验、亚硝酸钠中毒存活实验初步探究了牦牛血抗氧化低聚肽的抗缺氧活性。常压耐缺氧实验结果显示，不同剂量的牦牛血抗氧化低聚肽对小鼠常压缺氧耐受力均有不同程度的提高，并呈现剂量依赖性。高剂量组能显著延长常压缺氧小鼠的存活时间(P<0.05)；亚硝酸钠中毒存活实验显示，牦牛血抗氧化低聚肽高、中、低剂量组均能延长缺氧小鼠的存活时间，高、中剂量组的存活时间延长率极显著高于阳性对照组(P<0.01)。本研究结果提示，牦牛血抗氧化低聚肽具有提高小鼠抗缺氧应激的能力，可为抗缺氧保健食品做进一步研究。