徐珠锦 刘 军 谢文熙 陈 传 郭 震

广东医科大学病原生物学实验室,广东省湛江市 524023

不同细菌的芽孢形态和位置有较大差异，因此直接观察细菌的芽孢可作鉴定细菌的方法之一[1]。破伤风梭菌玻片标本是微生物实验教学不可缺少的标本，学生可通过破伤风梭菌玻片标本掌握芽孢形态结构和加深已学知识的理解。以往，我们传统制作破伤风梭菌玻片标本的方法主要有疱肉汤培养基和血平板培养基取菌液涂片方法，可是这两种方法制作的标本镜下观察不清晰或芽孢量少。我们在长期的医学微生物学实验准备过程中发现，通过用血清葡萄糖培养基代替传统方法培养破伤风梭菌制作的玻片标本，可以克服上述不足。同时又能制成长期保存的染色标本，以满足教学的需要，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 菌种 为本实验室保存的破伤风梭菌ATCC19406。

1.2 20%血清葡萄糖培养基的制备 取营养琼脂培养基3.3g加入蒸馏水100ml混匀溶解，高压灭菌后待培养基冷却至55～60℃时加入无菌20%葡萄糖20ml和无菌兔血清25ml混合轻轻摇晃均匀，倾注在15cm×10cm无菌平板上，冷却凝固后放置冰箱备用。

1.3 染色液的配制 结晶紫染液：称取结晶紫8g，溶于100ml 95%乙醇中制成饱和液。取20ml饱和液于80ml 10g/L草酸铵溶液混合即成，过滤后备用。结晶紫购于国药集团化学试剂有限公司，95%乙醇购于广州友联化学试剂厂。卢戈碘液：先将2g碘化钾溶于10ml蒸馏水中，再加1g碘，待碘全部溶解后加300ml蒸馏水。碘化钾和碘购于国药集团化学试剂有限公司[2]。

1.4 破伤风梭菌芽孢玻片标本的制作 传统的方法为将破伤风梭菌ATCC19406种于疱肉汤培养基中，放37℃培养箱培养48h，取培养液2ml经2 000r/min离心，沉渣重复洗绦2次，用接种环取菌液2环轻轻放置于载玻片上，放室温自然干燥，火焰加温固定。用孔雀绿水胞染色法进行芽孢染色[2-4]。

改进的方法为先按常规将分离后纯种的破伤风梭菌种在血清葡萄糖培养基平板上，放置于装有2小包厌氧产包的圆底立式厌氧培养袋中37℃培养箱培养48h， 随后在无菌空平皿中放5ml无菌生理盐水，首先在无盐水的地方用接种环刮取破伤风梭菌平板的菌苔于空平板上研磨，然后与盐水混匀。菌液放置5min后，取上清液涂片。放室温自然干燥，火焰加温固定。先用结晶紫溶液染1min，流水冲洗，用卢戈碘液媒染1min，流水冲洗，95%酒精脱水20s。染色待其自然干燥，2周后用中性树胶盖上盖玻片封片。营养琼脂培养基购自北京奥博星有限公司。2.5L圆底立式培养袋购自青岛海博生物技术有限公司。日本三菱MGC厌氧产包购自三菱瓦斯化学株会社。载玻片购于盐城汇达医疗机械有限公司。盖玻片盐城汇达医疗机械有限公司。中性树胶购自中国上海标本模型厂。

2 结果

图1显示，传统方法制得的标本背景脏，芽孢结构不清晰，在一个视野里细菌芽孢极少。图2显示，改进方法制得的标本背景清洁，形态结构完整清晰，在一个视野里几乎所有细菌都有芽孢形成。经过染色后芽孢内部为无色空泡，呈典型鼓槌状。

图1 传统方法的破伤风梭菌芽孢

图2 改良方法的破伤风梭菌芽孢

3 讨论

传统方法的破伤风梭菌芽孢之所以明显少于改良方法，分析原因可能如下：(1)疱肉汤培养基和血琼脂平板虽然营养成分均不是非常丰富，但相对于疱肉汤培养基来说营养成分过低，因此影响破伤风梭菌芽孢的繁殖生长。(2)破伤风梭菌属于严格厌氧的腐物寄生菌，芽孢是在细菌繁殖不利的条件才形成，是细菌抵抗不良环境的反应[5]。血清葡萄糖培养基平板因为缺乏C、N、P元素也可导致芽孢生成基因高表达从而使破伤风梭菌的芽孢形成增多[6]。(3)厌氧环境不同：破伤风梭菌为严格厌氧菌，必须在完全无氧的环境下培养才产生芽孢。传统的疱肉汤培养基是利用疱肉消耗液体中的氧气，使培养基达到缺氧环境，但疱肉消耗液体中的氧气非常有限，根本无法达到完全消耗液体中的氧气，而厌氧产气袋方法培养，操作方便简单，可通过化学反应完全消除厌氧袋中的氧气，造成厌氧效果更加明显。(4)传统的孔雀绿水芽孢染色法，染色时间长，操作繁琐，芽孢着色浅，对比不明显[7]，而结晶紫可使菌体和芽孢外膜着上紫色，但芽孢对水溶性染料的渗透能力差，芽孢不着色，加之折光系数高，从而导致外膜及菌体轮廓格外清晰，随后95%酒精短时间脱色使视野背景更加清洁[8]。

值得注意的是，采用制备血清葡萄糖培养基要注意加样的顺序，正确的加样顺序应是：第一步取营养琼脂培养基3.3g加入蒸馏水100ml混匀溶解后高压灭菌，第二步是等上述营养琼脂培养基冷却在55～60℃时取已准备好灭菌的20%葡萄糖20ml加入培养基中混均，第三步将灭活兔血清25ml加入培养基中混合均匀，这因为兔血清较黏稠难混合均匀，先加葡萄糖容易混合均匀，既可以降低培养基温度，又达到不破坏兔血清营养成分，同时又可避免营养琼脂培养基凝固过快，这样才能保证所配制的培养基混合均匀，取菌液染色时背影干净。

综上所述，改进方法制备的教学标本片，在一张标本片上可以看到破伤风梭菌的形态和芽孢结构，以及染色后呈革兰阳性菌，便于学生观察和理解。