吴合亮 潘靖丹 李美辰 杜晶晶 阴皓锋 安子熙 杜娈英

承德医学院，河北省承德市 067000

肺癌是一种对人类健康和生命威胁很大的恶性肿瘤，在我国肺癌发病率和死亡率呈上升趋势[1]。目前肺癌已位居恶性肿瘤发病率和死亡率之首，寻找一种作用靶点多而副作用少的药物至关重要。旋毛虫(Trichinella spiralis,T.spiralis)肌幼虫(Muscle-larva, ML)排泄分泌蛋白(Excretory-secretory proteins,ESPs)是从旋毛虫肌幼虫培养液中提取的一种生物活性物质。已有研究表明，旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白体外作用于某些肿瘤细胞能使其生长受到抑制，并能诱导肿瘤细胞发生凋亡[2]。肿瘤热疗(Hyperthermia,HT)主要是通过红外线、高频电磁波、热水浴、超声波等致热源，将肿瘤局部或全身加热到有效治疗温度并维持一段时间，以达到既可杀灭肿瘤细胞，又可不损害正常组织细胞的一种治疗方法，在肿瘤的综合治疗中发挥着重要的作用[3]。本研究以人小细胞肺癌H446细胞作为研究对象，观察了热疗联合旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白对H446细胞增殖的影响。

1 材料与方法

1.1 旋毛虫、实验动物和细胞株 实验所用旋毛虫为猪源旋毛虫，由本教研室保种。实验动物为清洁型健康成年昆明小鼠，体重18～32g，购自承德医学院动物实验中心。人小细胞肺癌H446细胞株购自上海北诺生物科技有限公司。

1.2 实验试剂 MTT，二甲基亚砜(DMSO)，BCA蛋白浓度测定试剂盒均购自上海索莱宝生物科技有限责任公司；RPMI1640培养基，胎牛血清，胰蛋白酶消化液(0.25%)购自美国Gibco公司；氯化钠购自天津市百世化工有限责任公司。

1.3 旋毛虫肌幼虫的收集和排泄分泌蛋白的制备 参照文献4的方法，提取旋毛虫肌幼虫，经过纯水多次洗涤沉淀后，用4%的明胶作为佐剂，对旋毛虫进行计数，调整虫体密度约为3 000条/ml,每只小鼠经口灌服0.1ml含旋毛虫肌幼虫的明胶，保虫35d后，采用颈椎离断法处死，去其四肢、内脏、脂肪等。取其肌肉，先用纯水多次洗涤，用干净的剪刀剪成小块状，再置于粉碎机内搅碎，加入1.5%的胃蛋白酶和1.5%的盐酸，于37℃恒温水浴锅中消化3～4h后，加入0.9%NaCl终止消化，100目无菌铜网过滤沉淀45min，去掉肉液，用生理盐水多次洗涤，获取旋毛虫肌幼虫。将纯净的旋毛虫肌幼虫移入含青链霉素的无血清培养基中，置于37℃、5%CO2培养箱培养24h，选择无污染、死虫率<5%的培养皿收集上清液(旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白)，4℃、12 000g离心30min，0.22μm滤膜过滤除菌后分装，采用BCA蛋白浓度测定试剂盒定量，-80℃保存。

1.4 H446细胞的培养与传代 在液氮中取出装有H446细胞的冻存管，置于37℃恒温水浴锅中快速完全消融，避免结晶伤害细胞。解冻后将冻存管置于离心机中离心，在超净台中小心弃掉冻存液。往冻存管中加入0.5ml RPMI1640培养基(含10%血清和1%青链霉素混合液)，重新悬浮细胞，吹打混匀后移入60mm培养皿，补加2.5ml培养基，放入37℃、5%CO2培养箱中继续培养。待细胞长到培养皿的90%～95%，进行细胞传代，3次传代后取对数生长期的H446细胞待用。

1.5 实验分组及给药 实验分为对照组、热处理组、ESPs处理组、热处理联合ESPs组。对照组：H446细胞培养过程中不作任何处理；热处理组：将细胞消化后放置离心管中在42℃水浴中加热2h；ESPs处理组：将提取的旋毛虫肌幼虫ESPs用无血清培养基稀释成0.15mg/ml、0.3mg/ml、0.6mg/ml，分别与H446细胞共培养；热处理联合ESPs组：先经水浴处理后加入各浓度的ESPs。

1.6 MTT法检测H446细胞增殖抑制率 按1.5分组处理细胞，取对数生长期的H446细胞用0.25%胰蛋白酶消化后，以6×103个/孔，接种于96孔培养板，每孔100μl，每组各设5个复孔，于37℃、5%CO2培养箱中培养24h后，吸弃上清。ESPs组、热处理联合ESPs组每孔加入200μl ESPs。对照组、热处理组每孔加入200μl不含ESPs的RPMI1640培养基，培养24h、48h后，每孔补加20μl MTT溶液(5mg/ml)，继续培养4h后吸弃上清，每孔加入150μl DMSO，振板10min,通过酶标仪测定吸光度OD值，计算不同处理方法对细胞的抑制率。抑制率=(1-实验组OD值/对照组OD值)×100%。

1.7 统计学方法 应用SPSS19.0进行统计学分析,数据用均数±标准差表示,数据间的比较采用ONEWAY-ANOVA，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

结果显示，热处理组、ESPs处理组、热处理联合ESPs处理组均对H446细胞有明显的抑制作用，呈现出剂量—时间依赖性效应(图1、图2)。H446细胞在ESPs单独作用下，随着药物浓度的逐渐增大，时间的延长，抑制率也在增大，与对照组比较差异有统计学意义(P<0．05)。热处理联合ESPs处理能抑制小细胞肺癌H446细胞增殖，并且随着药物浓度的逐渐增大，时间的延长，抑制率也增大，与对照组比较差异有统计学意义(P<0．05)。热疗联合ESPs处理组对H446细胞的抑制作用最强，与同时间同浓度ESPs处理组相比差异有统计学意义(P<0．05)，与同时间热处理组相比差异具有统计学意义(P<0．05)。见表1、表2。

图1 ESPs对H446细胞的抑制率

图2 热疗联合ESPs对H446细胞的抑制率

ESPs浓度(mg/ml)24h48h 0.1512.72±1.07∗16.25±0.95∗ 0.3017.11±0.59∗20.25±1.45∗ 0.6020.98±1.39∗28.09±3.17∗

注：与对照组比较，*P<0.05。

3 讨论

根据国家癌症中心发布的《2018中国肿瘤登记年报》显示，由于人口老龄化和新的不健康生活方式的出现，世界范围内的癌症负担正在迅速上升。

表2 热疗联合旋毛虫ESPs对H446细胞抑制率

注：与对照组比较，*P<0.05。

癌症是导致人死亡的主要原因之一，并在中国造成了沉重的疾病负担。其中肺癌位居恶性肿瘤发病率和死亡率第一位，且人数呈递增趋势[5]。因此如何安全、有效治疗肺癌在医学界受到广泛关注。

近年来肿瘤生物制剂的发现成为了研究热点。李慧萍等[6]成功构建了原核表达载体pET-28a(+)-A200711，A200711蛋白以包涵体形式在大肠杆菌中进行了高效表达。经SDS-PAGE及Westernblot分析确定蛋白为旋毛虫抗肿瘤基因A200711表达产物。将A200711蛋白作用于H7402细胞，发现随着浓度的增大，增殖抑制率也在增大，增殖抑制率与浓度之间存在量效关系，同时随作用时间的延长增殖抑制率也明显增加。陈文辉等[7]发现感染不同阶段旋毛虫的小鼠血清及幼虫抗原均可抑制乳腺癌MCF-7细胞活力，诱导其发生凋亡。罗婧梅等[8-9]研究发现旋毛虫肌幼虫排泄分泌蛋白(ESPs)存在抑制肿瘤的成分，并且能够发挥抑制小细胞肺癌H446增殖和诱导H446细胞凋亡的作用。

肿瘤热疗，即应用热能治疗肿瘤的一种方法，是继手术、放疗、化疗、生物等疗法之外的又一种重要的肿瘤治疗方法。热疗抗肿瘤的机制主要包括对肿瘤细胞膜和肿瘤细胞骨架的影响、对肿瘤血管的影响、引起肿瘤细胞的凋亡、提高自身免疫力等[10]。Kalamida等[11]研究发现，不同温度进行顺铂治疗肺腺癌H1299细胞的过程中，40℃热疗联合化疗治疗组与常温化疗组相比，H1299细胞存活率、增殖指数均明显下降，其中细胞存活率可减少2/3，同时研究发现热疗化疗联合治疗组的细胞内半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-9含量上升，热休克蛋白90含量下降。Wang等[12]的一项针对82例晚期非小细胞肺癌患者的随机对照试验研究发现，采用射频热疗联合GP方案(吉西他滨联合顺铂)治疗4周期的热疗化疗联合治疗组患者的临床获益率达90.70%，较单纯GP方案(71.79%)明显提高，同时两组患者化疗相关不良反应发生率差异无统计学意义。

本研究发现42℃加热2h联合旋毛虫肌幼虫ESPs可以抑制H446细胞增殖，与对照组比差异有统计学意义(P<0．05)。热疗联合ESPs处理组对H446细胞的抑制作用最强，组间比较差异有统计学意义(P<0．05)。H446细胞在ESPs单独作用下，随着药物浓度的增大，抑制率也在逐渐增大，浓度为0.15mg/ml、0.30mg/ml、0.60mg/ml的排泄分泌蛋白于48h抑制率分别达16.25%、20.25%、28.09%，单独热处理组，抑制率达49.50%。42℃加热2h联合旋毛虫肌幼虫ESPs，浓度为0.15mg/ml、0.30mg/ml、0.60mg/ml分别达49.98%、55.52%、57.46%，与同浓度单独使用比较差异有统计学意义(P<0．05)，说明42℃加热可增加细胞对ESPs的敏感性，为进一步研究提供了一定依据。