刘文全

（攀枝花学院，四川 攀枝花 617000）

目前我国市面上所销售的饮料中，含糖饮料占了相当一部分比例，但是含糖饮料的过多摄入与肥胖、龋齿及2 型糖尿病等一系列相关疾病的发生有密切联系[1-2]。随着我国居民消费理念的不断提升，人们开始意识到含糖饮料的危害，对饮料关注的更多是对营养、健康等需求，因此无糖型饮料越来越受关注[3-4]。无糖型饮料不意味着饮料没有甜度或在甜感上有所下降，而是添加一种糖替代品既保持饮品的甜味，又降低饮料的糖含量[5-6]。因为糖带来的甜味是大部分饮料产品畅销的基础，没有美好的甜感，消费者依然不会买单，因此寻找优质的糖的替代品成为研发者的重要课题[7-8]。

D-阿洛酮糖（D-psicose）是 D-果糖的 C-3 差向异构体，具有与蔗糖相近的口感及容积特性，其甜度相当于蔗糖的70%，但热量只有蔗糖的0.3%，且与其他D-酮糖（果糖、山梨糖等）相比，其反应产物具有突出的凝胶特性、起泡性、乳化稳定性以及良好的抗氧化性能，可以改善产品的风味、色泽及口感[9-11]。作为一种新型功能性低热量甜味剂，在食品开发应用中具有重要意义。特别是在饮料方面，近几年在无糖或低糖饮料中添加D-阿洛酮糖，产品与正常饮料具有相似的口感和甜度[12-15]。

目前，D-阿洛酮糖的检测研究方法并不多，本试验参照饮料中糖类物质的检测研究方法[16-18]，并结合其自身不易挥发、不易电离等特点，选择液相色谱法检测，并结合蒸发光散射检测器（evaporative light scattering detector，ELSD）对糖类物质无特性的检测要求，只基于样品颗粒对光的散射与质量呈指数关系的特点，应用于无糖饮料中D-阿洛酮糖的检测，并优化检测参数，开发一种简单、快捷的高效液相色谱-蒸发光检测器（high performance liquid chromatography-evapo rativelightscatteringdetector，HPLC-ELSD）的检测方法。

1 材料与方法

1.1 仪器与试剂

2695 型高效液相色谱系统、2428 型示差折光检测、2424 型 ELSD 检测器：Waters 公司；D-阿洛酮糖标准品：国家标准物质中心。

1.2 样品来源

样品均为随机购买市场上销售的无糖型饮料。

1.3 试验方法

1.3.1 色谱条件

色谱柱：ZORBAX 糖分析色谱柱（4.6 mm×250 mm，5 μm）；流速：1.0 mL/min；进样量：20 μL；柱温：30 ℃。

1.3.2 检测器的选择对糖分色谱行为的影响

糖类物质的检测一般都可以用示差折光检测（differential refraction detection，DRID）和蒸发光散射检测（evaporative light scattering detector，ELSD）这两种通用型来检测，本试验对两种检测器分析比较后，选择较合适检测D-阿洛酮糖的检测器。

1.3.3 流动相体系对D-阿洛酮糖色谱行为的影响

蒸发光散射检测器的流动相选用是易挥发的溶剂，所以本试验配制不同比例的流动相Ⅰ（乙腈∶水=10∶90，体积比）、流动相Ⅱ（乙腈∶水=20∶80，体积比）、流动相Ⅲ（乙腈∶水=30∶70，体积比）、流动相Ⅳ（乙腈∶水=40∶60，体积比），考察不同流动相体系对D-阿洛酮糖色谱峰的影响。

1.3.4 蒸发光散射检测器条件的优化

由于蒸发光检测器需要将样品和流动相进行雾化和蒸发，因此影响雾化和蒸发的漂移管温度、载气压力这两个参数十分关键，这两个参数主要是影响色谱图中的信噪比和目标物的峰面积，所以需要对这两个参数进行优化。试验考察了不同漂移管温度（40、50、60、70、80 ℃）和不同载气压力（10、20、30、40、50 psi）（1 psi=6.895 kPa）对检测D-阿洛酮糖的影响。

1.3.5 标准曲线的制作

称取一定质量D-阿洛酮糖标准品，配制成浓度为0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 g/100 mL 的标准溶液，进行仪器分析，以峰面积为纵坐标，浓度为横坐标绘制标准曲线。

1.3.6 前处理条件的优化

无糖型饮料中D-阿洛酮糖的提取，一般选用液液提取法进行提取，并选择HLB 小柱进行净化富集。参考相关文献并结合样品性质[19-20]，选择20%乙腈溶液进行D-阿洛酮糖的提取，并分别比较不同料液比、洗脱液对目标物测定值的影响。

1.3.7 加标回收试验

以市售无糖型饮料为基质，加入D-阿洛酮糖的标准溶液，选择优化后的前处理条件操作，上机检测，计算回收率。

2 结果与讨论

2.1 检测器的选择对D-阿洛酮糖色谱行为的影响

蒸发光散射检测器和示差折光检测器对D-阿洛酮糖色谱图的影响见图1。

结果如图1所示，示差折光检测器（DRID）和蒸发光散射检测器（ELSD）均采用外标法定量，都属于通用型检测器。但是相比较示差检测器，蒸发光检测器的灵敏度更高，基质干扰更小。这是由于两种检测器的不同检测原理决定的，示差检测器采用的原理是利用连续检测样品液流路与参比流路间液体折光指数差值来得到数值；而蒸发光检测器采用的原理是将样品液雾化形成微雾滴，然后在加热的漂移管中将微雾滴中的溶剂蒸发，余下的固态目标物在光散射检测池中得到检测数值。同样浓度的D-阿洛酮糖，在蒸发光检测器中得到的目标峰响应值更高，稳定性更好，所以试验选择蒸发光散射检测器进行检测。

图1 蒸发光散射检测器和示差折光检测器对D-阿洛酮糖色谱图的影响Fig.1 Effect of ELSD and DRID on D-psicose sugar chromatogram

2.2 流动相体系对D-阿洛酮糖色谱行为的影响

流动相对D-阿洛酮糖色谱图的影响见图2。

图2 流动相对D-阿洛酮糖色谱图的影响Fig.2 Effect of mobile phase on D-psicose sugar chromatogram

结果如图2所示，流动相中乙腈的比例对D-阿洛酮糖的保留时间影响显著，随着乙腈比例的增加，D-阿洛酮糖保留时间明显提前，容量因子逐步减小。当乙腈含量低于20%（体积分数）时，D-阿洛酮糖易于饮品中的乳糖、蔗糖峰形重叠，当饮品中含有乳糖或者蔗糖时，可能会造成假阳性，其中流动相Ⅲ（乙腈∶水=30∶70，体积比）的分离度最好，D-阿洛酮糖能与饮料中常规添加的糖类（葡萄糖、果糖、蔗糖、乳糖、半乳糖）能分开，且分离度较好，出峰时间合适。

2.3 蒸发光散射检测器条件的优化

2.3.1 载气压力条件的优化

试验保持漂移管温度50 ℃，考察0.10 g/100 mL D-阿洛酮糖标准溶液在不同载气压力下，信噪比（S/N）以及目标物峰面积的变化情况。载气压力对D-阿洛酮糖色谱峰的影响见图3。

图3 载气压力对D-阿洛酮糖色谱峰的影响Fig.3 Effect of carrier pressure on chromatographic peaks of D-psicose

结果如图3所示，载气压力对色谱图的信噪比影响较大，对目标物峰面积的影响较小。载气压力对色谱图的信噪比影响呈现先增大后减小的趋势，这可能是由于被测样品溶剂以微雾滴形式进入漂移管时，载气压力的调节主要影响样品溶剂的雾化程度，体现形式就是信噪比的变化。载气压力过小，雾化不充分，过大则可能导致目标物的损失，信号值降低。当载气压力为30 psi 时，信噪比达到最高，试验选择载气压力为30 psi。

2.3.2 漂移管温度条件的优化

试验保持载气压力为30 psi，考察0.10 g/100 mL D-阿洛酮糖标准溶液在不同的蒸发管温度下，信噪比（S/N）以及目标物峰面积的变化情况。漂移管温度对D-阿洛酮糖色谱峰的影响见图4。

结果如图4所示，漂移管温度在40 ℃增加到90 ℃时，对信噪比（S/N）的影响不大，但是目标物峰面积的影响较明显，其整体呈下降趋势。这可能是由于漂移管温度越高，雾化样品液的量越大，雾化液排空时损失的目标物越多，导致目标物的峰面积的变小。但是当蒸发管温度超过60 ℃后，目标物的峰面积更趋平缓，考虑到温度太低溶剂挥发不完全，基线不稳，试验选择漂移管温度为60 ℃。

图4 漂移管温度对D-阿洛酮糖色谱峰的影响Fig.4 Effect of drift tube temperature on chromatographic peaks of D-psicose

2.4 标准曲线的制作

为了验证D-阿洛酮糖在乙腈∶水=30∶70（体积比）流动相体系中的线性关系，配制了D-阿洛酮糖浓度分别为 0.01、0.05、0.10、0.20、0.40、0.80 g/100 mL 的系列标准溶液。试验结果表明，D-阿洛酮糖在0.01～0.80 g/100 mL 内均具有良好的线性关系（r2＞0.99），结果见表1。

表1 D-阿洛酮糖的保留时间、标准曲线、相关系数、检出限与定量限Table 1 Retention time，standard curve，correlation coefficient，detection limit and quantitative limit of D-psicose

2.5 前处理条件的优化

2.5.1 提取溶剂的选择

称取2.0 g 样品与20%乙腈提取液分别按1∶2、1∶5、1∶10、1∶15、1∶20（g/mL）的比例混合，超声提取30 min 后，在优化好的仪器条件下测定，以加标回收率为比较依据。不同比例提取液对D-阿洛酮糖的回收率的影响见图5。

图5 不同比例提取液对D-阿洛酮糖的回收率的影响Fig.5 Effect of different proportions of extracts on the recovery of D-psicose

结果见图5所示，当料液比为 1∶5、1∶10（g/mL）时，D-阿洛酮糖的测定回收率明显高于 1∶2、1∶15、1∶20（g/mL）时的含量。溶剂过少时，两相浓度梯度小，使D-阿洛酮糖不能完全溶出。随着料液比的增大，两相浓度梯度増大，D-阿洛酮糖逐渐溶出，回收率不断增加；料液比 1∶5（g/mL）时，D-阿洛酮糖的测定值最高，且误差线较小。当料液比达到1∶10（g/mL）时，进一步增加溶剂的量，可能会溶解更多样品中的其他的物质，妨碍D-阿洛酮糖的提取分离，导致D-阿洛酮糖的含量下降。而溶剂过多导致提取液浓度较低，不利于后续高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）检测，增大测定结果的误差，同时也会造成资源浪费，所以本试验的料液比选用1∶5（g/mL）。

2.5.2 洗脱液的选择

本试验选用HLB 固相萃取小柱对D-阿洛酮糖进行净化和富集，在对小柱的洗脱液方面分别比较了超纯水、25 %、50 %、75 %、100 %的甲醇溶液（体积比）5 种溶液的洗脱效果，结果以回收率为比较依据。洗脱液对D-阿洛酮糖回收率的影响见图6。

图6 洗脱液对D-阿洛酮糖回收率的影响Fig.6 The effect of eluent on the recovery of D-psicose

结果如图6所示，当甲醇体积分数为25%时，D-阿洛酮糖的回收率都比较高，此时25%甲醇的溶液洗脱能力较强，能较完全地洗脱目标物，所以本试验选择体积分数为25%的甲醇溶液作为样品的洗脱液。

2.5.3 洗脱液体积的选择

在选用25%甲醇作为HLB 固相萃取小柱洗脱液的基础上，比较了洗脱液体积对D-阿洛酮糖回收率的影响。分别比较了超纯水 1、2、3、4、5 mL 5 种体积对D-阿洛酮糖目标物洗脱效果的影响。洗脱液体积对D-阿洛酮糖回收率的影响见图7。

结果如图7所示，随着洗脱液体积不断增加，D-阿洛酮糖的回收率逐渐升高，但洗脱液体积达到3 mL以后再增加洗脱剂体积，D-阿洛酮糖回收率并没有明显增加，此时HLB 固相萃取小柱中的目标物较完全地被洗脱出，再增加洗脱液体积对D-阿洛酮糖的回收率影响不大，所以选择3 mL 为洗脱体积较合适。

图7 洗脱液体积对D-阿洛酮糖回收率的影响Fig.7 The effect t of eluent volume on the recovery of D-psicose

2.6 加标回收与相对偏差

分别添加 0.01、0.1、1.0 g/100 mL 共 3 个梯度浓度的D-阿洛酮糖标准溶液，进行加标回收试验，每个浓度重复测定5 次，结果见表2。

表2 方法的回收率及相对标准偏差（n=5）Table 2 Recoveries and relative standard deviations（RSD）of the method（n=5）

由表2可见，D-阿洛酮糖的加标回收率范围为91.5%～94.2%，相对标准偏差范围为3.1%～6.8%，表明本试验所建立的检测D-阿洛酮糖的方法具有可靠的准确度和精密度。

3 结论

本文建立了一种高效液相色谱-蒸发光检测器（HPLC-ELSD）检测无糖型饮料中D-阿洛酮糖的分析方法。结果表明，在流动相为乙腈∶水=30∶70（体积比），在载气压力为30 psi、漂移管温度60 ℃的条件下D-阿洛酮糖能得到良好的基线分离，其峰型良好，出峰时间合适。样品在经20%乙腈提取后，采用HLB 固相萃取柱法以3 mL 25%甲醇作为洗脱溶剂，可实现对D-阿洛酮糖的净化与富集，准确有效地检测无糖型饮料中的D-阿洛酮糖。