由璐，赵艳雪，隋茜茜，刘素稳，李凤英，常学东

（河北科技师范学院食品科技学院，河北 秦皇岛 066604）

欧李（Cerasus humilis（Bge.）Sok.）是我国特有的蔷薇科樱桃属野生果树，主要分布在北方部分省区[1]。其果实具有独特的浓郁香气，营养价值非常高，富含17 种氨基酸，VC，VB2，VE的总量以及 Ca，Fe，Zn，Se 的含量均高于现有常见果品，其中钙含量居水果榜首，又被誉为“钙果”[2]。但由于欧李果实不易贮存保鲜，开发加工产品已成为欧李产业开发的必由之路。

多酚广泛存在于果蔬组织中，有抗氧化和清除自由基功能，由于其在治疗心脑血管疾病、预防癌症以及抗衰老等方面有显著功效，广泛地应用于医疗和保健行业。欧李果含有较高抗氧化活性的酚类化合物，有极大的开发和利用价值[3]。以欧李果肉为原料，经过发酵酿造的欧李果酒呈宝石红色，酒香浓郁，酒体醇厚，余味绵长[4-5]，既能保留鲜果含有的大部分营养成分，又符合现代人追求健康、绿色、纯天然的理念。欧李酒品质中，颜色严重影响消费者的喜爱程度。花色苷是颜色的主要呈现物质，因而花色苷含量是欧李酒品质的一个重要指标。然而，果酒酿造过程中，由于微生物和温度等的影响，颜色损失严重。有研究表明，水浴，超声等预处理可提高果酒的品质。董华强等[6]在超声波处理强化杨桃酒的试验中发现经超声波可使香、味和酒体均有明显改善。对山楂酒的水浴处理能显著增加花色苷含量，增加酒体色度[7]。目前还没有将预处理运用到欧李酒的报道，本试验以欧李果为原料进行水浴、超声波预处理，酿成果酒。对不同处理的欧李果酒在发酵后色调、色度等理化特性进行比较，分析酚类物质的变化，从而进一步研究预处理对欧李酒抗氧化性的影响，为其应用提供有价值的参考和借鉴。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

欧李果：张家口六号，采自张家口坝上欧李果园。

果胶酶（≥1 000 U/mg）、福林酚试剂：上海源叶生物科技有限公司；白砂糖：市售，优级；活性酵母ZYMAFLORE FX10：法国 LAFFORT 公司；芦丁：国药集团化学试剂有限公司；没食子酸：天津市科密欧化学试剂开发中心；无水乙醇、盐酸、碳酸钠、亚硝酸钠、硝酸铝、氢氧化钠、磷酸二氢钾、磷酸氢二钠、乙酸、氯化钾、抗坏血酸、结晶乙酸钠（均为分析纯）：天津市风船化学试剂科技有限公司。

1.2 仪器与设备

SHA.B 型水浴恒温振荡器：常州金坛精达仪器制造有限公司；DHG-9245A 型鼓风干燥箱：上海慧泰仪器制造有限公司；723 型可见分光光度计：上海光谱仪器有限公司制造；YP601 电子天平（准确度级别Ⅲ）：上海精密科学仪器有限公司；SHB-Ⅲ循环水式多用真空泵：郑州长城科工贸有限公司；FG-118（BRIX/ATC）手持测糖仪：WD900B 型微波炉：顺德市格兰仕电器实业有限公司；JYL-C012 型九阳料理机：九阳股份有限公司。

1.3 方法

1.3.1 工艺流程

选取水浴、超声波处理后花色苷含量最多的两组以及对照组→打浆→调整成分（添加果胶酶、SO2、糖）→接种酵母→装罐→发酵

1.3.2 工艺要点

1.3.2.1 酿造前工艺要点

挑选无病虫害，无霉烂的欧李果，流动水清洗，备用。选用纯净水，与料液比1∶3（g/mL）进行搅碎。

1）对照组：未经任何处理，测量花色苷含量。

2）水浴组：水浴组在 30、40、50、60、70 ℃进行处理，每个温度间隔1 h 取样进行测量，测量花色苷含量。

3）超声波组：选用功率350 W，时间各为10、20、30、40 min 进行处理后取样，测量花色苷含量。

以上各组取欧李果5 g，搅碎破烂，放入烧杯中加纯净水15 mL，再做处理。

1.3.2.2 酿造工艺要点

选取200 g 干净无霉烂的欧李果，在预处理过后，加入果胶酶40 mg/L，搅拌均匀，放置24 h。加入SO280 mg/L 搅拌均匀，放置4 h 后再调糖。按照17 g/L 的糖生成1°酒，将欧李酒调成8°酒[8]。

活性干酵母的活化：添加量为0.2 g/L。在（35±1）℃取少许汁液进行活化，混匀轻搅后添加到欧李汁中，轻搅均匀[9]。当糖度不变发酵即结束。

在发酵 3、6、9 d 时取样检测。

1.3.3 理化性质测定

1.3.3.1 糖度的测定

取适量欧李酒于已调零的测糖仪上进行测定，读出示数并记录[10]。

1.3.3.2 pH 值的测定

取欧李酒适量进行抽滤，用pH 计读取pH 值，平行试验 3 次，取平均值[11]。

1.3.3.3 色度、色调的测定

取欧李酒澄清液，用分光光度计在420、520、620 nm分别测其吸光度，以蒸馏水做空白。每个样品重复测定 3 次取平均值[12]。

色度=A420nm+A520nm+A620nm

色调=A520nm/A420nm

1.3.4 酚类物质的测定

1.3.4.1 花色苷的测定

1）缓冲溶液的配置：①pH4.5 的缓冲液的制备：取醋酸钠18g，加冰醋酸9.8 mL，再加水稀释至1 000 mL。②pH 1.0 的缓冲溶液的制备：称取3.75 g 氯化钾用纯净水溶解并定容至250 mL。量取4.25 mL 盐酸用纯净水定容至200 mL，配成0.2 mol/L 盐酸溶液，将KCl 溶液与HCl 溶液混合，用KCl 溶液调pH 值至1.0[13]。

2）欧李酒中花色苷的测定：分别取1 mL 欧李酒澄清液用pH1.0 和pH4.5 的缓冲溶液定容至10 mL，在700、520 nm 处测其吸光度，每个样品重复测定3 次，取平均值[14-15]。

式中：A=（A520nm-A700nm）pH1.0-（A520nm-A700nm）pH4.5；MW 为矢车菊素-3-葡萄糖苷分子质量；DF 为稀释倍数；ε 为矢车菊素-3-葡萄糖苷消光系数（26900）；L 为比色皿光程。

1.3.4.2 多酚含量的测定

1）福林-酚法：称取 0.005、0.010、0.015、0.020、0.025、0.030 g 没食子酸定容至50 mL，移液枪分别吸取0.1 mL于10 mL 的刻度试管中，随后用移液枪吸取0.9 mL 纯净水加入试管中，同时依次加入5 mL 纯净水，1 mL 福林-酚显色剂和3 mL 7.5%的NaCO3溶液，震荡摇匀，避光条件下反应2 h 后，于765 nm 波长下测定吸光度[16]。以吸光度值为纵坐标，没食子酸质量浓度为横坐标，绘制工作曲线得出标准方程：y=1.296x-0.000 2，R2=0.999 3。

2）样品的测定：用移液枪准确吸取欧李酒澄清液0.2 mL，加去离子水至10 mL，即样液稀释50 倍，再按上述方法测定样品的吸光度[17-18]。用回归方程计算出样品溶液中多酚的含量。

式中：W 为多酚含量（结果以欧李果含有相当于没食子酸的毫克数表示）；C 为根据标准方程计算出待测液中多酚的质量浓度，mg/mL；V 为待测液体积，mL；N 为稀释倍数；M 为样品质量，g。

1.3.5 抗氧化能力测定

1.3.5.1 DPPH 自由基清除能力

称取0.003 9 g DPPH，用无水乙醇定容至100 mL，放容量瓶中备用，避光。

取1 mL 待测样品与3 mL DPPH 溶液（0.1 mmol/L，无水乙醇配制）混合并充分摇匀，避光静置30 min，然后在517 nm 处测定吸光度（A 样品）。同时，以等量蒸馏水代替样品作空白对照试验（A 空白）。以样品和无水乙醇混合液作为样品调零，以蒸馏水和无水乙醇混合液作为空白对照调零[19-20]。DPPH 自由基清除率由下列公式计算得出：

DPPH 自由基清除率/%=（A 空白-A 样品）/A 空白）×100

1.3.5.2 ABTS+自由基清除能力

1）将 7 mmol 的 ABTS 溶液和 2.45 mmol/L 的过硫酸钾等体积混合，避光的条件下静置过夜，形成ABTS+自由基储备液，使用前用0.01 mol/L 的磷酸缓冲液pH=7.4 稀释成工作液，使其在734 nm 下吸光度为0.70±0.02。

2）样品的测定：吸取1 mL 待测样品液与3 mL ABTS+自由基工作液，混合10 s 后在暗处准确反应6 min，在734 nm 波长下测定吸光度。同时以蒸馏水代替样品做空白对照试验，以样品和蒸馏水混合液作为样品调零，以4 mL 的蒸馏水为空白作为样品调零[21-22]。ABTS+自由基清除率由下列公式计算出：

ABTS+自由基清除率/%=（A 空白-A 样品）/A 空白×100

2 结果与分析

2.1 欧李果预处理后花色苷含量测定结果

除对照组外，通过预处理选取出花色苷含量最高作为酿造欧李酒的最佳条件。水浴对欧李酒花色苷含量的影响见表1。

表1 水浴对欧李酒花色苷含量的影响Table 1 Anthocyanin content in Cerasus humilis wines of control group and water bath group

超声波处理对欧李酒花色苷含量的影响见表2。

表2 超声波处理对欧李酒花色苷含量的影响Table 2 Ultrasound group Cerasus humilis wines anthocyanin content

通过表1与表2可以确定出酿造欧李酒各组的最优条件。在表1中可以看出，水浴组随着温度的升高，花色苷不断溶出，所以提取量也增加，不同提取温度之间欧李果酒花色苷提取量存在显著性差异。温度在50 ℃时花色苷含量达到最大，且显著高于其他时间段（P＜0.05），但当温度达到60 ℃时，花色苷含量开始下降。说明当提取时间继续延长，会破坏花色苷的稳定性，使其大部分开始降解，因此水浴组选择50 ℃作为最佳条件。从表2中可以看出，随着超声波处理时间的延长，花色苷含量呈现先升高后降低的趋势，在处理30 min 时花色苷含量最高，但当时间超过30 min 后花色苷含量开始下降，说明花色苷结构被破坏，或有其他物质溶出，因此超声波组选择30 min 作为最佳条件。

2.2 理化性质测定结果

2.2.1 发酵过程中糖度的变化

糖度是表示糖液中固形物浓度的单位，工业上一般用白利度（°BX）表示糖度，指的是100 g 糖溶液中，所含固体物质的溶解克数。随发酵天数的增加，各组糖度变化情况见表3。

表3 不同处理方式对欧李酒糖度的影响Table 3 Three groups of Cerasus humilis wines sugar changes°BX

从表3可以看出，第0 天到第6 天3 组欧李酒酵母降糖速率比较缓慢，说明此时酵母正在大量的繁殖阶段。从第6 天开始糖度大幅度下降，说明此时酵母已经过对数生长期进入了稳定期开始主发酵。

2.2.2 不同处理对欧李酒pH 值的影响

果酒中的酸类物质主要来自于两个部分：原料自带，发酵产生。其中反映酸度的指标为pH 值，pH 值越小，酸度越高。当果酒中酸度在一定范围时，可以良好的抑制杂菌的滋生、赋予果酒良好的风味。因此通过控制发酵过程中果酒的pH 值，来保证果酒的品质。酵母菌最适pH 值为4.5～5.0，但为了防止杂菌污染，多控制在3.5～4.5。不同处理方式对欧李酒pH 的影响见表4。

由表4看出，超声波和水浴处理对欧李酒pH 值影响都较小，均集中在一定的范围内波动，整个发酵过程中pH 值都维持在3.2～4.2 之间。各组在发酵期间0～6 d 内pH 值变化相对较大，从第6 天开始pH 值变化较小，但依然在降低。

表4 不同处理方式对欧李酒pH 值的影响Table 4 The effect of different treatments on the pH value of Cerasus humilis wines

2.2.3 发酵过程中色度的变化

色度是评价果酒外观质量的一个重要指标，根据果酒的色度和色调，可判断欧李酒的氧化程度和品质好坏[23]。不同处理方式对欧李酒色度值的影响见图1。

图1 不同处理方式对欧李酒色度值的影响Fig.1 Effect of different processes on the chromaticity value of Cerasus humilis wines

由图1可以看出，在整个发酵期间色度呈下降趋势，这表明显色物质的总量在减少，发酵12 d 时，超声波方式处理的酒样色度值高于水浴组（P＜0.05），与对照组没有显著性差异。在发酵过程中，处理方式不同色度损失的情况也不同，欧李果酒的色度主要由酚类物质花色苷、丹宁含量决定，同时也受样液pH 值等的影响。

2.2.4 发酵过程中色调的变化

不同处理方式对欧李酒色调值的影响见图2。

由图2中可以看出发酵过程中色调的变化结果，色调主要是反映各颜色间的变化、转移情况[24]。在发酵过程中，随着发酵时间的延长色调值大体上呈下降趋势，到发酵第12 天时，超声波组色调值较高，但3 种处理方式间无显著差异（P＞0.05）。色调值的变化部分与花色苷的降解有关，易导致欧李酒失去颜色。

2.3 酚类物质的变化

2.3.1 花色苷含量的变化

不同处理方式对欧李酒花色苷含量的影响见图3。

图2 不同处理方式对欧李酒色调值的影响Fig.2 Effect of different processes on the tonality value of Cerasus humilis wines

图3 不同处理方式对欧李酒花色苷含量的影响Fig.3 Effect of different treatments on anthocyanin content of Cerasus humilis wines

由图3可知，经3 种处理后的欧李酒，花色苷含量均随发酵时间的延长持续下降，均在发酵开始时达到最高值，这是由于随发酵天数的延长，花色苷受光照、pH 值、酶、糖及其降解产物等因素影响，所以含量逐渐减少。发酵第12 天时，对照组中花色苷含量为9.85 μg/mL，仅为对照组最高点的57.27%；水浴组中花色苷含量为16.59 μg/mL，为水浴组最高点的78.25%；超声波组中花色苷含量为17.26 μg/mL，为超声波组最高点的79.81%，经水浴和超声波预处理后花色苷含量均显著高于未处理酒样（P＜0.05）。有研究表明，酵母在生长发酵期间对花色苷进行了降解转化，使花色苷含量逐渐减少，花色苷的降解还与酵母在发酵过程中所产生的β-葡萄糖苷酶和发酵后期酚类物质氧化有关[25]。

2.3.2 多酚含量的变化

不同处理方式对欧李酒花多酚含量的影响见图4。

图4 不同处理方式对欧李酒花多酚含量的影响Fig.4 Effect of different treatment methods on polyphenol content in Cerasus humilis wines

多酚有抗氧化活性，能够抗辐射和衰老。程霜等[26]对欧李中的多酚类活性物质进行提取分离及性能评价，发现欧李中所含的相关多酚复合物有一定的自由基清除能力和抗氧化作用。图4中给出了欧李果酒发酵过程中多酚含量的变化过程。在发酵1 d～6 d 期间，3种处理下的多酚含量呈上升趋势。其中对照组多酚含量从 15.77 μg/mL 增长至 24.84 μg/mL、水浴组多酚含量从 18.43 μg/mL 增长至 25.26 μg/mL、超声波组多酚含量从 21.17 μg/mL 增长至 26.28 μg/mL，且显著高于对照组（P＜0.05）。原因可能是随着发酵的进行，酚类物质溶出，使发酵液中的浓度增大。在发酵第12 天时，对照组多酚含量降为20.22 μg/mL，比前6 d 降低了0.19%，水浴组多酚含量变为22.73 μg/mL，比前6 d 的时候降低了0.1%，超声波组多酚含量为24.09 μg/mL，比前6 d 降低了0.08%。

2.4 抗氧化结果测定

2.4.1 发酵过程中DPPH 自由基清除率变化

DPPH 自由基清除法是传统的抗氧化能力测定方法之一，广泛用于抗氧化物质自由基清除能力的测定[27-28]。自由基通常都不稳定，通过测定自由基清除力可以对抗氧化物质的抗氧化活性进行评价，自由基清除力会因测定对象的不同而得到不一样的结果。不同处理方式对欧李酒DPPH 自由基清除率的影响见图5。

由图5可知，DPPH 自由基清除率总体呈现先微弱上升后下降的趋势，与发酵过程中多酚含量变化趋势较符合。发酵前、中期，DPPH 自由基清除率缓慢上升，这是由于发酵速率较快，欧李果产生大量汁液，使得抗氧化性物质含量增加。发酵后期，由于酶的大量产生，酚类等大分子物质被大量分解，因此抗氧化性降低，从而导致DPPH 自由基清除率缓慢下降。

图5 不同处理方式对欧李酒DPPH 自由基清除率的影响Fig.5 Effects of different treatment methods on free radical clearance of Cerasus humilis wines by DPPH

2.4.2 发酵过程中ABTS＋自由基清除率变化

不同处理方式对欧李酒ABTS＋自由基清除率的影响见图6。

图6 不同处理方式对欧李酒ABTS＋自由基清除率的影响Fig.6 Effects of different treatment methods on free radical clearance of Cerasus humilis wines by ABTS+

利用ABTS＋自由基测定法来对提取物进行抗氧化活性的测量，能够避免植物提取物的自吸收，其主要原因是ABTS＋自由基的最大吸收波长位于734 nm。由图6可知，ABTS＋自由基清除率与DPPH 自由基清除率趋势变化几近相同，总体呈现先上升后下降的趋势。由于发酵中酚类物质会产生解离和聚合的复杂反应，且这些反应与温度、时间等多种因素有关，因此欧李果酒中多酚含量与ABTS＋自由基清除率呈正相关，此结论与焦扬等的研究结果一致[29]。

2.4.3 欧李酒多酚含量与抗氧化活性的相关性分析

欧李酒多酚含量与抗氧化活性的相关性分析见图7。

由图7可知，各组欧李酒的DPPH、ABTS＋自由基清除率与多酚含量均极显著正相关（P＜0.01），且相关系数分别为0.950 和0.958。尚红梅等[30]考察菊苣根多酚含量与抗氧化性能比较分析中，均发现受试样品中多酚含量与DPPH 自由基、ABTS＋自由基清除能力间呈显著正相关。前人大量研究也均表明，植物中的酚类物质具有很好的抗氧化性[31-32]，能有效地清除多种自由基，从而发挥预防和辅助治疗人类多种疾病的功能。试验结果表明，经过预处理的欧李酒抗氧化活性能力与它所含的多酚含量显著相关。

图7 欧李酒多酚含量与抗氧化活性的相关性分析Fig.7 Correlation analysis between polyphenol content and antioxidant activities of Cerasus humilis wines

3 结论

本试验研究了经预处理后的欧李酒在发酵期间花色苷、多酚、色泽及抗氧化活性的变化情况，并对结果进行了相关性分析，获得以下主要结论：欧李酒主发酵期间，酒液糖度、pH 值、色度、色调、花色苷含量呈下降趋势。多酚和抗氧化能力均呈先增加后降低。不同方式处理下的欧李酒均具有较强的抗氧化性，综合了多酚含量及抗氧化活性的相关信息，表明经预处理的欧李酒品质和抗氧化性都要优于未处理的欧李酒，为更进一步开发高品质的欧李果酒提供了可行途径。