单蕊，高妍，杜兰威，张弘

（天津市食品研究所有限公司，天津 301609）

色素按其来源分为天然色素和食用合成色素。合成色素[1]是人工合成的色素，其优点不少，如色泽鲜艳，着色力强，色调多样，但它有一个大缺点，具有毒性（包括毒性、致泻性和致癌性）。

目前国标测定色素的方法主要是GB 5009.35-2016《食品国家安全标准食品中合成着色剂的测定》[2]和SN/T 1743-2006《食品中的诱惑红、酸性红、亮蓝、日落黄的含量检测高效液相色谱法》[3]，两个方法均采用聚酰胺粉吸附法，但是聚酰胺粉吸附法，操作过程繁琐、耗费时间长，不利于批量检测[4]。本试验在创建同时检测食品中常见9 种色素的快速、准确的检测方法，提高日常检测工作效率，对国家监管合成色素批量检测有着重要意义[5]。高效液相色谱法（high performance liquid chromatography，HPLC）是现在检测合成着色剂最常用的检测方法。由于食品种类繁多，基质种类多、成分复杂同时多种着色剂同时添加，使得同时快速检测多种合成着色剂变得尤为重要[6]。

1 试验部分

1.1 仪器

UltiMate 3000 高效液相色谱仪（配备VWD3100紫外检测器）、LP Vorter Mixer 旋涡振荡器、thermo Hypersil GOLD C18 液相色谱柱（5 μm×4.6 mm×250 mm）：赛默飞世尔科技有限公司；AB265-S 电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；TGL-16M 型离心机：湘仪离心机仪器有限公司；SCI-NT2800D 型超声波清洗仪：天津市圣信唯仪器有限公司；Milli-Q 超纯水机：美国密理博公司；RE-52AA 旋转蒸发仪：上海亚荣生化仪器厂；CNWPoly-sery 150 mg/6 mL 固相萃取柱：上海安谱实验技术股份有限公司SPE 固相萃取柱150 mg/6 mL：博纳艾杰尔。

1.2 试剂

甲醇（色谱级）、氨水（分析纯）：德国默克公司；甲酸（分析纯）：天津市津东天正精细化学试剂厂；乙酸铵溶液（色谱级）：上海麦克林生化科技有限公司。

1.3 标准溶液的配置

柠檬黄、新红、苋菜红、胭脂红、日落黄、亮蓝、赤藓红、诱惑红、0.5 mg/mL 8 色素混合标准溶液（CDHWBW0724-1，4 ℃冰箱保存）；1.0 mg/mL 靛蓝标准溶液（CDHW-BW0726-1，4 ℃冰箱保存）：中国计量科学研究院。

标准使用液的配置：分别取1.0 mL 8 种色素混合标准溶液和靛蓝标液0.5 mL 混合，用纯水稀释10 倍，配置成 50 μg/mL 的混合标准溶液，经 0.22 μm 微孔滤膜过滤（4 ℃冰箱保存）。

1.4 样品处理

1.4.1 液体样品

称取1 g 试样于50 mL 离心管中，加入6 mL 去离子水，漩涡 30 s，超声振荡 15 min 提取，4 000 r/min 离心6 min，取上清液，残渣再加入6 mL 去离子水，重复操作1 次，合并两次上清液。用柠檬酸溶液（称取20 g柠檬酸，加水至100 mL，溶解混匀）调节pH 值至3～4（普通基质约需要250 μL，强酸强碱不参考此值）待固相萃取柱净化。

1.4.2 固体样品

称取1 g 试样于50 mL 离心管中，加入氨水∶70%甲醇溶液（甲醇和水体积比 70∶30）=（体积比 1∶99）10 mL 作为提取剂提取，漩涡15 s，超声提取15 min，4 000 r/min 离心6 min，再加入10 mL 提取液，重复提取2 次，合并上清液离心，取上清液，旋转蒸发至约5 mL。用柠檬酸溶液（称取20 g 柠檬酸，加水至100 mL，溶解混匀）调节pH 值至3～4，待固相萃取柱净化。

1.4.3 净化

上样：全部待净化液过柱，流速不能超过1 滴/s；淋洗用 5mL 甲醇∶甲酸∶水（体积比 4∶2∶4）；洗脱：10 %氨水甲醇3mL，重复1 次。氮吹近干，约200 μL左右，50%流动相A+50%流动相B 定容至1.0 mL，漩涡。过 0.45 μm 亲水性聚四氟乙烯（polytetrafluoroethylene，PTFE）滤膜过滤，待上机。避免用纯水定容，导致赤藓红不能完全溶解导致回收率降低。同时避免用尼龙过滤器，吸附色素。

1.5 色谱条件

色谱柱：thermoHypersilGOLD（金柱）C18 柱（5μm×4.6 mm×250 mm）；流动相：甲醇（A）+乙酸铵（B）0.02 mol/L 梯度洗脱；流速：1.0 mL/min ；柱温：35 ℃；进样量：10.0 μL；检测器：紫外检测器；波长：254 nm。梯度洗脱条件见表1。

表1 梯度洗脱条件Table 1 Gradient elution conditions

2 结果与讨论

2.1 色谱条件的选择

试验采用的色谱柱thermo Hypersil GOLD（金柱）C18 柱（5 μm×4.6 mm×250 mm），对 9 种合成色素都具有较好的分离效果，分别采用甲醇-0.01 mol/L 乙酸铵和甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵对样品进行梯度洗脱。混合标准溶液色谱图见图1。

结果表明：甲醇-0.02mol/L 乙酸铵灵敏度高且分离效果更好。C18 色谱柱thermo Hypersil GOLD （金柱）（5 μm×4.6 mm×250 mm）较普通 C18 柱具有更高的稳定性和重现性，能够更好的分离柠檬黄和新红，使用普通C18 柱经常会出现柠檬黄和新红不分离的现象。集国际先进的高纯硅胶技术、键合技术和烷基键合相的封尾技术于一身，thermo Hypersil GOLD C18色谱柱成为新一代高柱效硅胶基质色谱柱的代表，色谱柱适应pH 值的范围宽，在酸性条件和碱性条件下仍具有很长的寿命。在较高的盐浓度的条件下仍不会影响其使用寿命。采用甲醇-0.02 mol/L 乙酸铵进行梯度洗脱，在21 min 内均有良好的灵敏度和分离度。

图1 9 种合成色素混合标液色谱图Fig.1 Chromatogram of mixed standard solution for 9 synthetic pigments

2.2 固相萃取柱的选择

固相萃取[7]技术是目前常用的一种提取手段，能够更为有效的提取目标物，弃去杂质干扰进行分离，在检测领域使用广泛。国标中常采用聚酰胺粉吸附法净化，该方法前处理过程复杂，对pH 值要求严格，淋洗时，赤藓红损失较大，回收率低。故采用常用的两种固相萃取柱进行比较，分别是柱Oasis WAP HLB 为弱阴离子交换柱和CNW Poly-sery 为混合型弱阴离子交换柱，CNW Poly-sery 与传统的硅胶基质的小柱不同，PWAX 是改性的苯乙烯-二乙烯苯共聚物，其聚合物表面有亲水性和疏水性基团，pH 值在1～14 的范围内都非常稳定，并具有良好的水浸润性。

2.3 赤藓红净化方法改进

赤藓红为苯甲酸钠结构相对其他苯磺酸钠结构的合成着色剂，在CNWPoly-sery 固相萃取柱上的保留相对较弱，故要对净化方法进行优化，如按照1.4.3的方法淋洗，赤藓红不能全部被洗脱下来，通过方法优化最终的淋洗方法为6 mL 水（pH=6）、6 mL 甲醇选用CNWPoly-sery 固相萃取柱，其他条件不变。

2.4 线性范围及检出限

按照 1.3 配置浓度为 1.0、5.0、10.0、25.0、50.0 μg/mL的9 种色素混合标液，以进样浓度为横坐标，峰面积为纵坐标得到线性方程、回归方程、线性范围及检出限。9 种色素浓度与峰面积呈良好线性，可进行准确定量。以3 倍噪音极限确定检出限，结果为0.05 μg/mL。9 种合成色素的检出限、回归方程和线性范围见表2。

表2 9 种色素检出限及线性范围Table 2 Detection limits and linear ranges of 9 pigments

2.5 准确度及回收率试验

采用已知浓度样品加标方法计算回收率的方法，取红酒样品和固体基质，按照1.4.1 处理后进行测定，分别计算9 种合成色素的精密度及回收率，测定结果见表3。

表3 9 种色素不同浓度加标回收率和精密度Table 3 Standard recovery and precision of 9 pigments at different concentrations

该方法测定不同加标浓度下的回收率为92.0%～97.6%，相对标准偏差为1.05%～2.52。实际检验结果证明，各组分浓度与峰面积呈现良好的线性关系。

2.6 实际样品的测定

对市场上的商品（糖果、果汁[8]、肉制品、葡萄酒[9]、固体饮料）进行检测，测定结果见表4。

表4 实际样品测定结果Table 4 Results of actual sample determination

所测定的结果均符合国家标准GB 2760-2014《食品安全国家标准食品添加剂使用标准》[10]中所规定限量标准要求。糖果样品色谱图见图2，果汁样品色谱图见图3，固体饮料色谱图见图4。

通过对实际样品的检测，运用文中1.4 的样品处理方法，能够更快更全面提取食品中的色素，方法简便、缩短了检测周期，在实际样品检测中取得了良好的效果。

图2 糖果样品色谱图Fig.2 Chromatogram of candy samples

图3 果汁样品色谱图Fig.3 Chromatogram of juice samples

图4 固体饮料色谱图Fig.4 Chromatogram of solid beverage

3 结论

试验建立了固相萃取-高压液相色谱法同时测定食品中9 种合成色素的方法。该方法通过对样品前处理方法的优化、固相萃取柱的选择和色谱柱的选择，确定最优的色谱条件。所优化的液相色谱条件可同时测定9 种食品中色素，各种合成色素得到有效的分离。通过实际样品检测，得到了较好的试验效果。能够满足在日常工作检测要求，提高了检测效率，改善了传统检测，避免检测色素较少的会有遗漏的情况。