固相萃取UPLC-MS/MS测定黄酒中2-甲基咪唑和4-甲基咪唑

2019-07-17公丕学廉贞霞薛霞宿书芳孙珊珊程志王骏刘艳明

食品研究与开发 2019年14期

公丕学，廉贞霞，薛霞，宿书芳，孙珊珊，程志，王骏，刘艳明，*

（1.山东省食品药品检验研究院，山东济南 250100；2.山东省药学科学院，山东济南 250100）

黄酒是一种以稻米为原料酿制成的粮食酒，是中国最古老的饮料酒，也是世界三大酿造酒之一。黄酒没有经过蒸馏，酒精含量低于20%[1]。黄酒中主要使用的食品添加剂为焦糖色，种类不同的黄酒呈现出米色、黄褐色或红棕色，焦糖色是一种被允许广泛用于食品及饮料中使用的着色剂[2]，在生产氨法焦糖色和亚硫酸铵法焦糖色时会产生4-甲基咪唑。研究发现，4-甲基咪唑能导致动物长肿瘤，也有可能给人体带来致癌风险[3]，2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在世界卫生组织国际癌症研究机构公布的致癌物2B 类致癌物清单中[4]。欧盟食品安全委员会允许在食物中添加含有4-甲基咪唑的焦糖色素，但每千克不能超过200 mg。我国GB 1886.64-2015《食品安全国家标准食品添加剂焦糖色》中规定，4-甲基咪唑在液体食品中含量小于0.02%，与世界卫生组织限量要求相同[5]。

黄酒中含有氨基酸、多酚、类黑精、谷胱甘肽等生理活性成分，容易干扰测定，因此样品处理中提取净化是难点[1]。样品提取、净化方法主要有溶剂提取QuEchers 法[6]和固相萃取法[7]等。检测甲基咪唑的方法有气相色谱法（gas chromatography，GC）[8-9]、液相色谱法[10-13]、气相色谱-质谱联用法[14-16]、液相色谱-质谱联用法[17-21]、拉曼光谱法[22]、酶联免疫法[23]、分光光度法[24-25]、电化学色谱法[26-27]、毛细管电泳法[28]等。目前，对于黄酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑则没有相关检测方法和数据。液相色谱串联质谱法具有液相色谱的高效分离能力和四级杆质谱的定性定量能力，因此液相色谱串联质谱法被广泛应用于食品有毒有害物质的分离分析检测。

本试验建立一种定性定量准确的超高效液相色谱串联质谱法同时测定黄酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑，定量评价目标物及同位素内标在黄酒中的基质效应，使用阳离子固相萃取方法对黄酒进行净化，提取和浓缩2-甲基咪唑及4-甲基咪唑，同时结合亲水作用色谱（hydrophilic interaction chromatography，HILIC）的保留模式，对于黄酒中2-甲基咪唑及4-甲基咪唑达到完全的色谱分离效果，实现准确的定性定量。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

2-甲基咪唑标准品、4-甲基咪唑标准品、4-甲基咪唑-D6 标准品：德国Dr.Ehrenstorfer 公司；甲醇、乙腈、甲酸铵：色谱纯，德国Merck 公司；三氯乙酸（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；MCX 固相萃取柱（3 mL/60 mg）、ACQUITY UPLC BEH Amide（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC HSS T3（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH C18（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）、ACQUITY UPLC BEH HILIC（1.7 μm，2.1 mm×100 mm）：美国 Waters 公司。

1.2 仪器与设备

Waters ACQUITY 超高效液相色谱仪：美国Waters公司；AB SCIEX Triple Quad 5500 三重四极杆质谱分析仪[配有电喷雾离子源（electron spray lonization，ESI）及MultiQuant 数据处理系统]：美国SCIEX 公司；MS-3旋涡混合器：德国IKA 公司；SB-800DTD 超声波清洗器：宁波新芝生物科技股份有限公司；3-18k 高速冷冻离心机：德国SIGMA 公司；Milli-Q 超纯水机：美国Millipore 公司；N-EVAP-45 温控氮吹仪：美国 Organomation 公司。

1.3 标准溶液配制

标准物质储备液：分别称取适量的2-甲基咪唑标准品和4-甲基咪唑标准品，用乙腈配成1 mg/mL 的标准物质储备液，4 ℃避光贮存。

同位素内标储备液：分别称取适量的4-甲基咪唑-D6 标准品，用乙腈配成1 mg/mL 的标准贮备液，4 ℃避光贮存。

系列标准工作溶液配制：准确移取1 mg/mL 混合标准中间溶液和1 mg/mL 4-甲基咪唑-D6 标准中间溶液适量，用乙腈-10 mmol/L 甲酸铵溶液（95∶5，体积比）稀释，配制成 0.1、1、10、20、50、100、500、1 000 ng/mL系列浓度的混合标准工作溶液，其中4-甲基咪唑-D6浓度为10 ng/mL，供液相色谱-串联质谱测定。

1.4 方法

提取：称取2.0 g 黄酒于50 mL 塑料离心管中，加入100 μL 100 ng/mL 同位素内标工作溶液，加入10 mL 1%三氯乙酸，超声15 min，8 000 r/min 离心5 min，取出待净化。

净化：MCX 固相萃取柱依次用6 mL 甲醇，6 mL水活化，取待净化溶液上柱，控制流速1 mL/min，待上样完成后分别用5 mL 2%甲酸淋洗，5 mL 甲醇淋洗，然后用9 mL 5%氨水甲醇洗脱，收集洗脱液在45 ℃恒温水浴中氮吹至洗脱液近干，定量加入1.0mL 乙腈-10 mmol/L 甲酸铵溶液（95∶5，体积比）复溶，超声溶解，过0.22 μm 有机滤膜，滤液供超高效液相色谱串联质谱（ultra-high performance liquid chromatographytandem mass spectrometry，UPLC-MS/MS）测定。

1.4.1 色谱条件

色谱柱：BEH HILIC；柱温：40 ℃；流速：0.3 mL/min；进样量：2.0 μL；流动相：A：10 mmol/L 甲酸铵，B：乙腈，梯度洗脱程序见表1所示。

1.4.2 质谱条件

离子源：电喷雾离子源（ESI）；扫描方式：正离子扫描；检测方式：多反应监测；气帘气：20.0 L/h，碰撞气：8 L/h，离子喷雾电压：5 000 V，离子源温度：500 ℃，喷雾气：50 L/h，辅助加热气：50 L/h。

表1 流动相梯度程序Table 1 Gradient program for mobile phase

1.4.3 基质效应评价

样品基质效应的存在明显影响质谱方法定量的准确性，因此有必要对建立的质谱方法进行基质效应考察。在经过样品前处理后加入标样，通过比较，可以定量评价目标物的基质效应。为了评估黄酒样品在提取净化处理后的基质效应，可以通过比较相同浓度的目标物在标准溶液和黄酒处理液中响应值。可以通过公式1计算：

式中：A 为标准溶液中分析物的峰面积；B 为样品处理液中分析物的峰面积。

在不含2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的黄酒样品中加入与标准溶液相同浓度的标准物质。如果基质效应约等于0 %，说明没有基质效应；如果基质效应大于0 %，说明出现了离子抑制效应，即基质抑制；如果基质效应小于0 %，说明出现了离子增强效应，即基质增强。

2 结果与分析

2.1 固相萃取柱的优化

由于2-甲基咪唑和4-甲基咪唑化合物分子较小（结构式见图1），但极性很大，在样品中含量范围较宽，所以如何快速、准确地检测出其含量就成为研究的重点。

图1 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的结构式Fig.1 Chemical structure formula of 2-methimazole and 4-methylimidazole

为了提高试验的灵敏度和准确度，分别试验了不同类型的固相萃取柱Bond Elut C1（8C18）、Waters OASIS MCX（MCX）、Waters OASIS HLB（HLB）、和 Waters OASIS MAX（MAX）对2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率，用10 ng/mL 两种目标物标准溶液过固相萃取柱得到回收率如图2所示，结果表明使用Waters OASIS MCX（MCX）固相萃取柱时回收率最好，因此Waters OASIS MCX（MCX）固相萃取柱被用于后续试验前处理样品净化步骤中。

图2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑通过不同固相萃取柱的回收率Fig.2 The recoveries of 2-methylimidazole and 4-methylimidazoleon different solid-phase extraction（SPE）columns

2.2 固相萃取柱洗脱条件的优化

考察了固相萃取柱洗脱液甲醇中氨水体积分数对2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的洗脱能力，结果见图3。

图3 洗脱液中氨水比例优化Fig.3 Optimization of solid-phase extraction（SPE）condition

在洗脱液中氨水体积分数对目标物洗脱有较大影响，目标物回收率随氨水体积分数增加而增加，当体积分数达到5%时回收率最高，当氨水体积分数升高时，回收率略有降低。当氨水体积分数为5%时回收率最高，表明此时洗脱能力最强，因此选择体积分数5%氨水作为洗脱溶液。

2.3 基质效应评价结果分析

在不含2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的黄酒样品中加入与标准溶液相同浓度的标准物质。如果基质效应约等于0 %，说明没有基质效应；如果基质效应大于0%，说明出现了离子抑制效应，即基质抑制；如果基质效应小于0%，说明出现了离子增强效应，即基质增强。

通过1.4.3 基质效应评价公式计算黄酒样品对目标物的基质效应，200 ng/mL 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑标准溶液的基质效应分别为52.1%和54.5%，说明黄酒样品对目标物有抑制，纯标样外标法定量样品含量偏差较大，该分析方法不适合选择外标法定量方式。

结果表明黄酒样品对目标物有基质抑制的作用，因此选择定量方式为同位素内标法定量，比外标法定量更准确，建立的方法能对黄酒中的2-甲基咪唑和4-甲基咪唑能够准确定量。

2.4 色谱分离条件的优化

试验中采用ESI+模式，使用易挥发的甲酸铵流动相能提高2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的离子化效率，响应信号强度增加，提高灵敏度，因此在流动相中加入10 mmol/L 的甲酸铵，以提高目标化合物的离子化效率和改善峰形，故本试验选用乙腈-10 mmol/L 甲酸铵为流动相体系。

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在4 根色谱柱的分离结果如图4所示。

图4 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑在4 种色谱柱分离效果Fig.4 Separation effect of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole on 4 chromatographic columns

通过几种色谱柱分析结果可以看出，BEH HILIC色谱柱在分离两种目标化合物时有较好的分离度和更好的峰形，而两种化合物在BEH Amide 色谱柱的峰型有明显拖尾和色谱峰展宽现象，BEH C18和HSS T3色谱柱出峰时间较早，无法对两种化合物进行有效分离，无法进行定性和定量，故本试验采用BEH HILIC色谱柱进行分离检测。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑分子分子量较小、极性较大，与反相色谱柱中固定相之间的相互作用力较弱，不容易保留，一般会在流动相中使用离子对试剂来增加目标物保留，但是流动相中含有离子对试剂时在仪器及色谱柱平衡时间较长，最关键是离子对试剂进入质谱后容易造成污染，给质谱分析带来困难。HILIC 模式色谱分离方法能够对强极性分子有较好的保留，所用流动相比较简单，能够与质谱更好兼容，对2-甲基咪唑和4-甲基咪唑分离效果更好，灵敏度更高。

2.5 质谱条件的优化

2-甲基咪唑和4-甲基咪唑均含一个仲氨基基团和一个叔氨基基团，在ESI 源电离下容易获取H+，形成[M+H]+准分子离子峰，因此本试验中选用ESI 源正离子多反应监测式检测。为了使化合物具有较高的灵敏度，在做一级质谱扫描时，通过优化电离源参数毛细管电压和锥孔电压，使母离子响应强度最大；在做二级质谱扫描时，在碰撞气和碰撞电压的作用下能够使目标化合物发生断裂或重排，从而产生不同的碎片离子。在碰撞作用下甲基咪唑分别丢失一个-C2H3和一个-C3H5N，甲基咪唑分别对应产生m/z 56 和m/z 28的碎片离子。碎片离子分别作为目标化合物的定性与定量离子对，并优化各自碰撞电压，使两对子离子响应最强。2-甲基咪唑，4-甲基咪唑及同位素内标物的关键质谱参数见表2。

2.6 方法的线性范围和检出限

以目标化合物丰度较高定量离子峰面积与内标物峰面积比值为纵坐标，以对应2-甲基咪唑和4-甲基咪唑标准工作溶液的浓度（ng/mL）为横坐标，绘制标准工作曲线，得出线性回归方程、线性相关系数、检出限（以信号与噪音比值S/N≥3 作为检出限计算）等，结果见表3。标准溶液定性离子色谱图见图5，定量离子色谱图见图6。

表2 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑及同位素内标关键质谱参数Table 2 The optimized mass spectrometry（MS）parameters of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole and internal standard（IS）

表3 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑线性方程、线性相关系数和检出限Table 3 Linear equations，correlation coefficients and limits ofdetection of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

图5 2-甲基咪唑和4-甲基咪唑定性离子（82.9＞28）色谱图Fig.5 Qualitative ions（82.9 ＞ 28）chromatograms of 2-methylimidazole and 4-methylimidazole

2.7 方法的回收率和精密度

采用两种不同类型黄酒样品，进行添加回收率和精密度的试验。黄酒样品中分别添加10、50、100 μg/kg和500 μg/kg 4 个浓度水平，按照建立的方法进行处理，每个理论添加水平平行测定6 次。同时使用标准溶液进行回收率和相对标准偏差计算，结果见表4。2-甲基咪唑和4-甲基咪唑的回收率在96.3%～106.0%。每个添加水平平行测定6 次，测定结果表明相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）为 3.5%～6.1%。结果表明，本试验方法能够用于实际样品检测。