姚宏亮，沈洁，佴逸凡

（金陵科技学院食品科学系，江苏 南京 210038）

莲藕是我国种植面积最大且产量最高的水生蔬菜品种[1]，主要种植于湖北、江苏、山东、安徽、福建、湖南、浙江等地区[2]。莲藕除用于菜肴类原料加工之外，其工业化生产主要有速食藕片、藕粉、藕汁等。莲藕营养丰富，其在多种常见蔬菜中体现出了相对较强的抗氧化能力[3]，这与其含有丰富的植物多酚类物质密切相关。植物多酚广泛存在于植物各个部位，具有抗氧化[4]，免疫及抗炎症[5]，预防阿尔茨海默病及帕金森综合征[6]，抗癌作用[7]，抑菌[8]等多种生物活性功能。近年来，天然产物中植物多酚的生理活性受到国内外研究者的广泛关注。植物多酚类物质在莲藕的不同部位含量不同，藕节最高，其次是藕皮，再者是藕可食部分[9]。莲藕的加工形式主要有水煮藕片、冷冻藕夹、藕粉、莲藕汁等，在这些产品的加工过程中，产生大量的藕皮废弃物，不但造成环境污染还浪费资源。因此，开展莲藕废弃物中多酚类物质的提取及抗氧化特性研究十分必要，不仅可以变废为宝，提高经济价值，并且可以减少环境污染，具有良好的社会效益和经济效益。

植物多酚的提取有溶剂萃取法、超声波提取法、微波提取法等[10]，其中溶剂萃取法最为经典、应用最为广泛。关于莲藕中多酚的提取研究国内已有不少报道，如周玮婧等对莲藕藕节中的多酚进行了提取[11]并对多酚提取物进行了体外抗氧化活性[12]研究。覃海明[13]对莲藕中多酚的提取及抗氧化活性进行了评价。关于藕皮中植物多酚的提取研究还较少，刘焕云[14]对藕皮中的多酚类物质进行了提取并对其抗油脂氧化的能力进行了分析，藕皮中多酚提取物清除自由基能力的研究分析尚未见报道。本文采用乙醇萃取法对废弃藕皮中的植物多酚进行提取，并分析多酚提取物清除自由基的能力，旨在为废弃藕皮的增值利用提供理论基础和技术参考。

1 材料与方法

1.1 材料与仪器

莲藕皮：扬州华贵食品有限公司。

硫酸亚铁、酒石酸钾钠、磷酸氢二钠、磷酸二氢钾、焦性没食子酸、无水乙醇、乙二胺四乙酸二钠（EDTA二钠）、抗坏血酸、双氧水：分析纯，国药集团化学试剂有限公司；番红花红T、1，1-二苯基-2-苦基肼（1-1-diphenyl 2-picryl hydrazyl ，DPPH）：生物试剂，上海源叶生物有限公司。

酒石酸亚铁溶液配制：取硫酸亚铁1.0 g 以及酒石酸钾钠5.0 g，定容至1 L；磷酸盐缓冲溶液配制：将0.066 7 mol/L 的磷酸氢二钠溶液以及0.066 7 mol/L 的磷酸二氢钾溶液以84∶16 的比例混合再调节pH 值至7.5。

HH-2 数显恒温水浴锅、85-1 型恒温磁力搅拌器：常州润华电器有限公司；FA 1204B 型/YP1002N 型电子天平：上海精密天美科学仪器有限公司；Alpha-1860型紫外可见光分光光度计：上海谱元仪器有限公司；KQ-800KDV 型超声波清洗器：昆山市超声仪器有限公司；OHG-907385-Ⅲ型电热恒温鼓风干燥箱：上海新苗医疗器械制造有限公司；RHP-400 型高速多功能粉碎机：永康市荣浩工贸有限公司；DDL-5M 低速冷冻离心机：上海卢湘仪离心机仪器有限公司。

1.2 方法

1.2.1 原料的预处理

将藕皮用清水洗净后置于60 ℃恒温干燥箱中连续干燥6 h，然后用多功能高速粉碎机粉碎，并用100目筛网进行过筛，备用。

1.2.2 多酚含量的测定及标准工作曲线的建立

参考文献[15]，采用酒石酸亚铁法测定多酚含量，以焦性没食子酸溶液作为标准品绘制标准曲线。将获得的藕皮多酚提取物按同样的方法测定吸光度，计算多酚含量。

配制浓度为0.25 mg/mL 的标准焦性没食子酸溶液，然后用微量移液器分别吸取 0.0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0 mL，置于一系列刻度试管中，用超纯水将溶液体积补至为1.0 mL，再加入酒石酸亚铁溶液1.0 mL，然后加入pH7.5 的磷酸盐缓冲溶液3.0 mL，混匀，静置15 min，随后在540 nm 处测定吸光度值，以焦性没食子酸标准溶液的浓度为横坐标，以其吸光度值为纵坐标，绘制成标准工作曲线。

1.2.3 藕皮中多酚的提取

精确称取0.5 g 藕皮粉于离心管中，加入一定量一定浓度的乙醇溶液，置于一定温度的水浴锅中水浴提取一段时间。提取完成后进行离心（3 780 g，4 ℃，10 min），取上清液定容至25.0 mL。准确吸取1.0 mL 样液于刻度试管中，加酒石酸亚铁溶液1.0 mL，加磷酸盐缓冲溶液3.0 mL，混匀，静置15 min，随后在540 nm 处测定其吸光值。同时用1.0 mL 超纯水代替1.0 mL 样液作空白对照试验。测定出吸光值后，通过焦性没食子酸标准工作曲线计算得出莲藕皮中多酚物质的浓度c，再利用下列公式计算多酚提取得率。计算公式：

式中：w 为莲藕皮中多酚类物质提取得率，mg/g；c为提取液中多酚的质量浓度，mg/mL；V 为提取液的体积，mL；m 为莲藕皮粉的质量，g。

1.2.4 藕皮中多酚提取工艺优化

1.2.4.1 单因素试验

采用1.2.3 方法提取得到藕皮多酚。提取条件为：固定料液比 1∶20（g/mL），提取温度 80 ℃，提取时间3 h，考察不同乙醇浓度（30%、40%、50%、60%、70%）对提取得率的影响；固定料液比1∶20（g/mL），提取温度80 ℃，乙醇浓度为50 %，考察不同提取时间（2、3、4、5、6、12、24 h）对提取得率的影响；固定料液比1∶20（g/mL），乙醇浓度为 50%，提取时间为 3 h，考察不同提取温度（50、60、70、80、90 ℃）对提取得率的影响；固定乙醇浓度为50%，提取时间为3 h，提取温度为 80 ℃，考察不同料液比[1∶5、1∶10、1∶15、1∶20、1∶25、1∶30、1∶35、1∶40、1∶45、1∶50（g/mL）]对提取得率的影响。

1.2.4.2 正交试验

在单因素试验的基础上，每个因素选取3 个水平，建立四因素三水平L9（34）正交试验。通过正交试验对提取工艺进行优化。

1.2.5 藕皮多酚体外抗氧化能力的测定

1.2.5.1 羟基自由基消除率测定

采用Fenton 体系OH·清除法，参考文献[16]并做适当改动：取0.2 mol/L pH7.4 磷酸盐缓冲溶液1mL、0.52 mg/mL 番红溶液 0.2 mL，0.2 mol/L EDTA 二钠溶液 0.5 mL，0.2 mol/L FeSO4溶液 0.5 mL，不同浓度的样品溶液（抗坏血酸或藕皮多酚提取物）7 mL，超纯水0.8 mL，混匀，然后在 40 ℃水浴加热 30 min，测定520 nm 处吸光值，记为A参比；用0.3%双氧水溶液代替上述操作中的超纯水，重复操作，测定520 nm 处吸光值，记为A样液，用超纯水代替A样液操作中的样品溶液，测定520 nm 处吸光值，记为A羟基，用超纯水代替A参比操作中的番红溶液及样品溶液，测定520 nm 处吸光值，记为 A空白。

1.2.5.2 DPPH 自由基消除率的研究

参考文献[17]并作适当改动：取1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液及3 mL 无水乙醇；取1 mL 0.2 mmol/L DPPH-乙醇溶液及3 mL 样品溶液（抗坏血酸或藕皮多酚提取物）；取1 mL 无水乙醇溶液及3 mL 样品溶液（抗坏血酸或藕皮多酚提取物）在暗处静置30 min，用分光光度计在517 nm 处测其吸光值，分别记为A0、AX、AX0。用4 mL 无水乙醇作为空白对照。

1.2.5.3 超氧阴离子自由基（O2-·）自由基消除率的测定

采用邻苯三酚自氧化法，参考文献[18]并做适当改动：取 4 根试管，分别标注为 1、2、3、4 号。在 1、2 号管里分别加入超纯水1 mL，50 mmol/L pH 8.2 Tris-HCL缓冲液3 mL，在3 号管里加入100 mmol/L HCl 1 mL，在4 号管里加入5 mmol/L 邻苯三酚1 mL。将这4 管放入25 ℃水浴锅里保温10 min，然后将3 号管中物倒入1号管里，4 号管中物倒入2 号管里，迅速混匀，在325nm 处测5min 内吸光值A0的变化。根据吸光值A0作图得到邻苯三酚自氧化速率K0。按照上述步骤将1、2 号管里的超纯水替换成不同浓度的样品溶液（抗坏血酸或藕皮多酚提取物）。放入25 ℃水浴锅里保温10 min 后迅速混匀。测5 min 内吸光值A1的变化。根据吸光值A1作图得到分光光度值变化速率K1。

1.2.6 数据分析

试验重复3 次，数据结果以平均值±标准偏差的形式表示。数据分析采用EXCEL，IBM SPSS Statistics 22 软件，制图采用Adobe Illustrator 软件。

2 结果与分析

2.1 标准工作曲线

焦性没食子酸标准溶液在浓度范围0.01 mg/mL～0.05 mg/mL 内，吸光值（Y）与浓度（X）呈良好的线性关系，线性方程为 Y=18.083X-0.008（R2=0.999 2）。标准工作曲线如图1所示。

图1 焦性没食子酸标准曲线Fig.1 The standard curve of pyrogallic acid

2.2 藕皮中多酚提取工艺优化

2.2.1 单因素试验结果

单因素试验结果见图2。

由图2-A 可以看出：随着乙醇浓度不断上升，多酚提取得率也在逐步增大，当乙醇浓度达到50%时，多酚提取得率达到最大值，而如果再继续增大乙醇浓度多酚提取得率反而下降。由图2-B 可以看出：当提取时间增加，多酚提取得率也在逐步增大，当提取时间达到3 h 时，多酚提取得率达到最大值，如果再继续增大提取时间则多酚提取得率反而下降，将提取时间延长至12、24 h，多酚提取得率依旧呈现略微趋势。由图2-C 可以看出：随着提取温度不断上升，多酚提取得率也逐步增大，且当提取温度为80 ℃时，多酚提取得率达到最大值，且70、80、90 ℃时的提取得率差异不显著。考虑到温度高对反应条件不友好，且有可能对多酚物质造成破坏，因此提取温度宜选择80 ℃左右。随着乙醇浓度、提取时间、提取温度的增加，多酚提取得率均呈现先提高后下降或趋于平衡的结果。这应该与植物原料中纤维素在上述因素的作用受到破坏促进多酚物质提取，而随后而当乙醇浓度过大时，加热时间过长，提取温度过高则可能会破坏多酚类物质，导致多酚提取得率的降低[19]。由图2-D 可以看出：随着提取液比例不断增加，多酚提取得率也逐步增大，且当料液比达到1∶25（g/mL）时，多酚提取得率达到最大值，此时如果再继续提高料液比多酚提取得率趋于平缓。这应该是物料中所能提取的多酚类物质几乎达到极限，即使再增加提取溶剂也不能显著地提高多酚提取得率。

2.2.2 正交试验结果

2.2.2.1 因素水平设计。

根据2.2.1 单因素试验结果，选定乙醇浓度、料液比、提取温度，提取时间作为正交试验的因素，各因素的水平如表1所示。

图2 单因素试验结果Fig.2 The result of single factor experiment

2.2.2.2 正交试验结果

藕皮多酚类物质提取工艺的正交试验结果如表2所示。

表2 藕皮多酚类物质提取正交试验结果Table 2 The orthogonal experiment of polyphenol extraction from lotus skin

续表2 藕皮多酚类物质提取正交试验结果Continue table 2 The orthogonal experiment of polyphenol extraction from lotus skin

从表2可以看出：各因素对多酚提取效果影响的主次顺序依次为乙醇浓度＞提取温度＞提取时间＞料液比，利用IBM SPSS Statistics 22 进行分析得知：各因素对提取得率的影响均极显著（P＜0.01）。根据正交试验分析的结果，多酚提取得率最高的理论组合应为A1B3C3D1，而正交试验最佳组合中实际多酚提取得率最高的工艺组合为A1B3C3D3。将理论组合A1B3C3D1进行试验，所得到的结果与正交试验最佳组合进行t 检验，两者差异极显著（P＜0.01）。考虑节省时间以及提取得率的因素，确定A1B3C3D1最佳工艺组合，即乙醇浓度40%、料液比 1∶30（g/mL）、提取温度 90 ℃、提取时间2 h，此条件下多酚提取得率为（4.45±0.05）mg/g。和发表文献[14]相比，本研究中多酚提取得率略低，这可能与研究所使用的莲藕皮产地与品种[20]以及新鲜程度有关。随后选用一批藕皮废弃物，将其分别晒干（2 d）、烘干（60 ℃，6 h）、冻干（-40 ℃，12 h）后用高速粉碎机粉碎，过100 目筛，按照优化工艺进行多酚物质提取，多酚提取得率分别为（1.09±0.04）、（4.45±0.05）、（5.09±0.05）mg/g，经 t 检验，三者之间差异极显著（P＜0.01）。这一试验结果以及相关文献[21-22]证实了多酚的稳定性受到原料处理方式、氧气、光照等多种因素的影响。证实了晒干方法简单无需设备和能量消耗，但需要大量场地，晒制受天气因素影响大，时间长，且由于晒制过程中受阳光照射、氧气等作用使得多酚物质氧化，造成多酚活性物质损失；烘干需要设备和能量的消耗，但能在较短时间内处理藕皮样品，较大限度地保留多酚类活性成分；冻干设备成本较高，处理时间长，能最大限度地保留多酚类活性成分。3 种不同处理方式的试验结果给藕皮多酚提取工业化生产提供了参考。

2.3 藕皮多酚提取物体外抗氧化能力

将得到的藕皮多酚提取物按比例进行稀释，对其进行了抗氧化能力的检测，并与抗坏血酸的抗氧化能力进行比较，结果见图3。

图3 藕皮多酚提取物体外抗氧化能力测定结果Fig.3 The antioxidant properties detection in vitro of polyphenol from lotus skin

图3-A～C 显示：1 mg/mL 的抗坏血酸对羟基自由基清除作用只有28.83%，而0.15 mg/mL 的藕皮多酚提取物对羟基自由基消除率达91.01 %，其IC50为0.026 mg/mL；0.3 mg/mL 的抗坏血酸对DPPH 自由基消除率为48.87%，而0.2mg/mL 的藕皮多酚提取物对DPPH自由基清除作用为81.39%，其IC50为0.020 mg/mL；0.05 mg/mL 的抗坏血酸对O2-自由基消除率为98.68%，而0.05 mg/mL 的藕皮多酚提取物对O2-自由基消除率为71.62%，其IC50为0.009 mg/mL。由此可知，藕皮多酚提取物对羟基自由基清除能力以及DPPH 自由基清除能力均优于抗坏血酸，而O2-自由基清除能力略差于抗坏血酸。

3 结论

本文以莲藕加工中的藕皮废弃物为原料，以乙醇溶液为提取剂进行了多酚物质的提取，得到最佳提取工艺，此外，体外抗氧化试验结果显示：藕皮多酚提取物对羟基自由基、DPPH 自由基消除率、O2-自由基消除率分别最高可达92.45%、82.11%、80.41%；证实藕皮多酚提取物具有很好的抗氧化能力。本研究对莲藕加工中的废弃物利用具有重要的参考价值，并在环境保护、减少污染等方面具有一定的社会意义。