付丽，高雪琴，胡晓波，*，郝修振，马路石

（1.河南牧业经济学院食品工程系，河南 郑州 450046；2.河南伊赛牛肉股份有限公司，河南 焦作 454450）

牛肉营养丰富、高蛋白质、低脂肪，早已是中国人主要消费的肉类，且在肉类消费中的比重增加最快[1]，预测我国2025 年牛肉需求量可达到1 200 万吨[2]。冷鲜牛肉更是具有鲜嫩、美味、安全、卫生等优点而深受消费者喜爱[3]，在发达国家达100%的市场占有率[4]。但由于0 ℃～4 ℃贮存并不能完全抑制微生物的生长，贮藏、运输、销售过程中易受污染而发生腐败变质，造成冷鲜牛肉货架期短。近年来，国内外有关屠宰后牛胴体减菌技术、冷鲜牛肉保鲜技术的研究报道较多，但对于牛肉初始菌相以及冷藏过程中品质及菌相变化的研究较少，由于缺少理论基础研究，使得保鲜技术、减菌技术的针对性不强，效果不佳，因此进行冷鲜牛肉贮藏过程中品质变化及菌相变化的研究具有重要意义。

本试验以冷鲜牛肉为研究对象，测定其在0 ℃～4 ℃条件下贮藏第0、1、3、5、7 天时的感官指标、挥发性盐基氮（total volatile basic nitrogen，TVB-N 值）、pH 值、硫代巴比妥酸反应物值（thiobarbituric acid reactive substances，TBARS 值）、菌落总数和大肠菌群等指标的变化并进行指标间相关性分析，研究冷鲜牛肉贮藏期间感官品质、新鲜度的变化；采用选择性培养基对0 ℃～4 ℃下贮藏第 0、1、3、5、7 天的冷鲜牛肉中乳酸菌、假单胞菌、肠杆菌以及热死环丝菌的生长情况进行测定，初步分析冷鲜牛肉贮藏过程中的优势腐败菌，为冷鲜牛肉保鲜新技术的开发提供一定的指导。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

原料肉（牛后腿肉）：由河南伊赛牛肉股份有限公司提供。宰前检验合格的活牛屠杀后，进行排酸后剔骨分割，并由冷藏车在0 ℃～4 ℃条件下2 h 内运输到实验室。

氧化镁、硼酸、盐酸、甲基红、三氯乙酸、KCl、甘油等（均为分析纯）：河南华丰试剂股份有限公司。

平板计数琼脂培养基、CFC 选择性培养基、STAA选择性培养基、VRBGA 选择性培养基、MRS 琼脂培养基（均为生物试剂）：河南华丰股份有限公司。

塑料保鲜盒（方形，650 mL）：苏州康百乐餐饮用品公司。

1.2 仪器与设备

DHP-080 电热恒温培养箱：郑州生元仪器有限公司；SHA-B 水浴恒温振荡器：金坛市杰瑞尔股份有限公司；LDZX-50KBS 立式压力蒸汽灭菌锅：上海申安医疗仪器公司；K9840 半自动凯氏定氮仪：济南海能仪器股份有限公司；BlueStarB 紫外可见分光光度计：北京莱泊泰科股份有限公司；PHSJ-3F 酸度计：上海仪器海电股份偶限公司；2.5L 厌氧培养罐：日本三菱瓦斯化学株式会社。

1.3 试验方法

1.3.1 肉样的处理

先开启无菌室紫外灯照射30 min 后，再将肉样拿入无菌室。在无菌条件下打开包装取出牛肉，剔除表面结蹄组织、多余脂肪、筋膜等，用无菌刀和案板将牛肉切成 5 cm×5 cm×5 cm 大小肉样，共 30 块，将处理好的肉样在无菌的条件下充分混合以保证肉样初始菌数一致。将肉样分为5 组，每组6 块，分别装入事先编号的无菌保鲜盒内，加盖，放于0 ℃～4 ℃的冷鲜库货架上，备用。

1.3.2 保鲜盒包装冷鲜牛肉贮藏期间感官品质及新鲜度的变化

分别在贮藏第 0、1、3、5、7 天时从冷库内取出肉样，每次3 盒。检测肉样的感官指标、挥发性盐基氮值（TVB-N）、pH 值、硫代巴比妥酸反应物值（TBARS）、菌落总数、大肠菌群数的变化及指标间相关性分析，研究肉样贮藏期间感官品质及新鲜度的变化。

1.3.3 保鲜盒包装冷鲜牛肉中菌相的初步分析

分别在贮藏 0、1、3、5、7 天时从冷库内取出肉样，每次3 盒。在无菌条件准确称取绞碎的肉样25 g，放入盛有225 mL 无菌生理盐水的均质袋中，然后放入均质机中拍打均质30 s 获得10-1稀释菌液，逐级稀释。选择2～3 个合适稀释度的菌液，采用涂布法接种于CFC、STAA、MRS 琼脂及 VRBDA 琼脂 4 种选择性培养基中，每个稀释度做个重复，待凝固后编号，倒置恒温培养，进行菌数计数，研究保鲜盒包装冷鲜牛肉中优势腐败菌的生长变化，观察菌落形态并进行革兰氏染色、动力学试验等进一步菌种鉴定。根据《常见细菌系统鉴定手册》和《伯杰细菌手册》对典型菌落进行氧化酶、过氧化氢酶及精氨酸双水解酶试验。

1.4 检测指标

1.4.1 感官指标

参照GB/T 22210-2008《肉与肉制品感官评定规范》[5]中感官指标评定方法及孙凯旋等[6]感官评价方法并稍做改动。由10 名食品专业人员组成评定小组，评定指标包括色泽、气味、黏度、弹性四项，每项满分均为25 分，采用百分制，四项指标评分加合为肉样的总评分。感官指标评分标准见表1。

表1 感官指标评价标准Table 1 Sensory evaluation criteria

1.4.2 TVB-N 测定

测定方法按GB 5009.228-2016《食品安全国家标准食品中挥发性盐基氮的测定》[7]中的半微量凯氏定氮法进行。将肉样绞碎混匀后，取10 g 放于干净的消化管内，加入75 mL 蒸馏水，静置30 min，加入1 g 氧化镁。用全自动凯氏定氮仪进行TVB-N 值测定。其值≤15 mg/100 g 为一级新鲜牛肉，≤20 mg/100 g 为二级，≥20 mg/100 g 时则为变质肉[8-9]。

1.4.3 pH 值测定

取绞碎的肉样40 g，放于盛有100 mL 0.1 mol/L KCl 溶液的烧杯中，参照GB/T 5009.237-2016《食品安全国家标准食品pH 值得测定》[10]进行测定。正常冷鲜牛肉 pH 值为 5.8～6.2，次级鲜肉 pH 值为 6.3～6.6，变质肉 pH＞6.7[11]。

1.4.4 TBARS 值测定

测定方法按GB 5009.181-2016《食品安全国家标准食品中丙二醛的测定》[12]中分光光度法进行。当TBARS 值大于0.5 mg/kg 时，就会产生因脂肪氧化而产生的酸败味[13]。

1.4.5 菌落总数的测定

测定方法按照GB 4789.2-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验菌落总数测定》[14]规定的方法进行。肉样新鲜度评价参照欧丽娟等[15]和Duun 等[16]的标准：菌落总数＜4.0log（CFU/g）为新鲜肉，在 4.0log（CFU/g）～6.0log（CFU/g）之间为次鲜肉，＞6.0 log（CFU/g）为变质肉。

1.4.6 大肠菌群测定

依据GB4789.3-2016《食品安全国家标准食品微生物学检验大肠菌群计数》[17]中第二法大肠菌群平板计数法进行测定。

1.4.7 假单胞菌、乳酸菌、热死环丝菌及肠杆菌的分离与计数

Russo 等[18]研究得出，热死环丝菌、假单胞菌、肠杆菌和乳酸菌是牛肉冷藏过程中生长的优势菌种，因此本试验采用这4 种菌进行分离与计数。参照陈锐颖[13]的方法，分别采用相应选择性培养基进行分离培养并进行平板计数。培养温度为（30±1）℃，培养时间为48 h。

1.5 数据处理与分析

每个试验重复3 次，结果表示为平均数值±标准差，图表采用Sigmaplot13.0 绘制，数据采用SPSS Statistics 20.0 统计分析软件进行显著性分析和相关性分析，显著性水平为0.05，极显著水平为0.01。

2 结果与讨论

2.1 冷鲜牛肉贮藏期间感官品质及新鲜度的变化

2.1.1 冷鲜牛肉贮藏期间感官指标的变化

冷鲜牛肉贮藏期间感官指标变化图1。

由图1可知，随着贮藏时间的延长，肉样的感官评分呈逐渐下降的趋势。以第0 天肉样感官评分为100为标准，第1 天肉样感官评分为98，与第0 天时差异不显著（P＞0.05）；从第3 天开始，肉样的感官评分呈极显著下降（P＜0.01），第 5 天时为 61，属次鲜肉；第 7 天时肉样的感官评分为42，说明肉样已腐败。

2.1.2 冷鲜牛肉贮藏期间TVB-N 的变化

冷鲜牛肉贮藏期间TVB-N 变化见图2。

图1 冷鲜牛肉贮藏期间感官评分雷达图Fig.1 Radar map of sensory score of chilled beef during storage

图2 冷鲜牛肉贮藏期间TVB-N 值变化Fig.2 Changes in TVB-N of chilled beef during storage

挥发性盐基氮是牛肉在腐败过程中，由于细菌分解蛋白质产生的胺类碱性含氮物质。由图2可知，随着贮藏时间的延长，肉样的TVB-N 值呈逐渐上升的趋势（P＜0.05），尤其是第 3 天开始，肉样的 TVB-N 值呈极显著增加（P＜0.01）。第 0 天时肉样的 TVB-N 值为 8.016 mg/100 g；贮藏 1 天后 TVB-N 值增加为8.621 mg/100 g，第 3 天增加为 10.762 mg/100 g；第 5 天肉样的TVB-N 值达到15.774 mg/100 g，为次鲜肉；肉样贮藏第7 天时，TVB-N 值超过20 mg/100 g，说明肉样已腐败。张婷[19]研究得出自封袋包装的冷藏牛肉贮藏 2 天后 TVB-N 值接近 15 mg/100 g，5 d 后超标。张铁华等[20]研究未经包装的冷鲜牛肉贮藏第5 天时TVBN 值已超过20 mg/100 g，这说明保鲜盒包装在一定程度上可以延长牛肉的货架期。

2.1.3 冷鲜牛肉贮藏期间pH 值的变化

冷鲜牛肉贮藏期间pH 值变化见图3。

图3 冷鲜牛肉贮藏期间pH 变化Fig.3 Changes in pH of chilled beef during storage

由图3可知，随着贮藏时间的延长，肉样pH 值呈逐渐增加的趋势，且从第3 天开始肉样的pH 值显著增加（P＜0.01）。在第 1 天时肉样的 pH 值为 5.83，与第0 天时差异并不显著（P＞0.05），说明肉样非常新鲜；第3 天时肉样的pH 值增长为5.90，与第1 天相比差异极显著（P＜0.01），原因是肉样蛋白质在腐败菌产生的蛋白酶作用下分解成胺类等碱性物质使pH 值升高，但肉样仍为鲜肉；第5 天时肉样的pH 值大于6.00，这与陈锐颖[13]的研究结果是一致的。第7 天时肉样的pH 值为6.14，仍小于6.20，原因可能是肉样采用塑料盒加盖包装，造成了一定的厌氧环境，使好氧菌生长受到一定的抑制，而乳酸菌等兼性厌氧菌生长繁殖产生一定量的乳酸，使肉样pH 值升高延缓，这是图7中得到了证实。

2.1.4 冷鲜牛肉贮藏期间TBARS 值的变化

冷鲜牛肉贮藏期间TBARS 变化见图4。

图4 冷鲜牛肉贮藏期间TBARS 值变化Fig.4 Changes in TBARS of chilled beef during storage

由图4可知，随着贮藏时间的延长，肉样的TBARS值呈逐渐上升的趋势。第0 天时肉样的TBARS 值为0.05 mg/kg，贮藏 1 d 后，该值极显著升高（P＜0.01），贮藏第7 天时该值达到0.238 mg/kg，仍小于0.5 mg/kg，原因可能是也于肉样采用塑料盒加盖包装有关。

2.1.5 冷鲜牛肉贮藏期间菌落总数的变化

冷鲜牛肉贮藏贮藏期间菌落总数变化见图5。

图5 冷鲜牛肉贮藏过程中菌落总数变化Fig.5 Changes in colony count of chilled beef during storage

由图5可知，随着贮藏时间的延长，肉样菌落总数呈逐渐上升的趋势。第0 天时肉样菌落总数对数值为4.61，贮藏 1 d 后为 4.73，两者差异并不显著（P＞0.05），原因是0 ℃～4 ℃贮藏能有效的抑制菌落总数初期的生长。贮藏3 天时肉样菌落总数显著增加（P＜0.05），其对数值达到5.46，说明第3 天是肉样菌数增长的对数期，即为抑菌的最佳时期。贮藏第3 天至第7 天时肉样菌落总数仍呈上升趋势，但增长速度减慢（P＞0.05），说明细菌生长接近稳定期。第5 天时肉样菌落总数对数值已接近6.0，说明肉样已为次鲜肉。第7 天时肉样菌落总数对数值已超过6.0，说明肉样已腐败。这与李升升与靳义超[21]研究得出的托盘包装的冷鲜牛肉的在第9 天时菌落总数对数值仍低于6.0 的结果不一致，可能是原料肉初始菌数及包装形式不同的原因。

2.1.6 冷鲜牛肉贮藏过程中大肠菌群变化

冷鲜牛肉贮藏过程中大肠菌群变化见图6。

图6 冷鲜牛肉贮藏期间大肠菌群变化Fig.6 Changes in the number of coliform of chilled beef during storage

由图6可知，随着贮藏时间的延长，肉样大肠菌群数呈逐渐增加的趋势。贮藏第1 天和第0 天时肉样大肠菌群数差并不显著（P＞0.05），原因是低温条件下贮藏能在短期内有效控制大肠菌群的增长。贮藏3 d后肉样大肠菌群数显著增加（P＜0.05），尤其是贮藏第7 天时肉样大肠菌群数与第5 天时的值差异极显著（P＜0.01）。

2.1.7 指标间相关性分析

肉样感官指标及新鲜度指标相关性分析结果见表2。

表2 肉样指标间的相关性分析Table 2 Correlation analysis among five indexes in specimens

由表2可知，pH 值与TVB-N 值呈极显著正相关，且均与菌落总数呈显著正相关，这与李升升与靳义超[21]研究发现的在反映肉新鲜度上，pH 值、TVB-N 与菌落总数相关性大的结果一致，说明三者都能很好的反映肉品的新鲜度。与李飞燕[22]研究得出的保鲜袋包装冷却牛肉贮藏期间pH 值与TVB-N 值、菌落总数呈显著正相关的结论也是一致的。肉样感官品质评分与pH值、TVB-N 值、菌落总数呈极显著负相关，原因是pH值、TVB-N 值、菌落总数评价肉样新鲜度的主要指标，其值越高说明肉样越不新鲜，则感官评分越低，说明肉品的品质与肉品的新鲜度密切相关，通过测定肉品鲜度指标可反映肉品质；TBARS 值是反应肉样中脂肪氧化酸败的指标，其值越高则肉样越不新鲜，与pH值、TVB-N 值及菌落总数呈显著相正相关，与感官品质呈显著负相关，说明TBARS 值也能很好的反应肉品质。

2.2 保鲜盒包装冷鲜牛肉中菌相的初步分析

2.2.1 冷鲜牛肉中假单胞菌、乳酸菌、热死环丝菌及肠杆菌的生长变化

冷鲜牛肉贮藏期间假单胞菌、乳酸菌、热死环丝菌及肠杆菌变化见图7。

图7 冷鲜牛肉贮藏期间几种菌菌数变化Fig.7 Changes in the number of several bacteria of chilled beef during storage

由图7可知，假单胞菌、乳酸菌在第0 天时菌数对数值分别为4.93 和4.95，显著高于热死环丝菌（P＜0.05），说明这两种菌在牛肉贮藏第0 天时为优势菌；肠杆菌的菌数对数值为2.15，菌数最低（P＜0.01）。贮藏第1 天到第3 天时假单胞菌、乳酸菌、肠杆菌数呈上升趋势，而热死环丝菌菌数无显著变化（P＞0.05），其中假单胞菌和乳酸菌数仍然显著高于热死环丝菌（P＜0.05）和肠杆菌（P＜0.01），说明这两者菌落还是优势菌。第5天时热死环丝菌、假单胞菌和乳酸菌菌数差异不显著（P＞0.05），但均显著高于肠杆菌（P＜0.01），以热死环丝菌数最高。第7 天时，假单胞菌菌数对数值最高为6.04，显著高于乳酸菌和热死环丝菌（P＜0.05）及肠杆菌（P＜0.01）。可见在保鲜盒包装的冷鲜牛肉中主要优势腐败菌为假单胞菌，其次为乳酸菌和热死环丝菌，肠杆菌的菌数相对比较少。

陈锐颖等[13]研究真空包装牛肉的优势腐败菌为乳酸菌和假单胞菌，其次热死环丝菌和肠杆菌；张铁华等[20]研究发现无包装鲜牛肉贮藏过程中G-杆菌为主要菌系，真空包装鲜牛肉中主要菌系的G+球菌，说明不同包装形式贮藏的牛肉菌相会有所不同。Xiong[23]研究得出保鲜袋包装冷却牛肉中优势菌为假单胞菌和希瓦氏菌属，在4 ℃条件下，货架期为5 d。XU 等[24]研究得出普通包装和气调包装（modified atmosphere packaging，MAP）包装冷却牛肉中假单胞菌和热死环丝菌为优势菌群。保鲜盒包装并不是密封包装，也会有一定的透氧率，嗜冷菌假单胞菌G-杆菌，专性需氧，比较适于生长，为冷鲜牛肉贮藏过程中的优势腐败菌[25]；热死环丝菌为微需氧菌，乳酸菌为兼性厌氧菌，也是主要腐败菌。

2.2.2 冷鲜牛肉菌相的初步鉴定

菌落形态特征及初步鉴定结果见表3。

表3 菌落形态特征与生化试验结果Table 3 Colony morphology and biochemical test results

由表3可知，经菌落观察及生化试验鉴定4 种选择性培养基中生长菌分别为假单胞菌属/乳杆菌、热死环丝菌及肠杆菌科。

3 结论

保鲜盒包装冷鲜牛肉贮藏期第1 天时与鲜肉无显著差异；贮藏第3 天时，肉样的pH 值、TVB-N 值、TBARS 值以及菌落总数、大肠菌群均显著增加，但肉样仍比较新鲜；贮藏第5 天时肉样为次鲜肉，第7 天时肉样各项指标均已超标，且感官评分较低，成为腐败肉。说明保鲜盒包装冷鲜牛肉在0 ℃～4 ℃条件下贮藏时间需控制在5 d 内，最适贮藏期为3 d。这与程述震[26]结论是一致的。通过指标相关性分析发现，pH 值与TVB-N 值呈极显著正相关，均与菌落总数呈显著正相关，说明三者都能很好的反映肉品的新鲜度。肉样感官品质评分与pH 值、TVB-N 值、菌落总数呈极显著负相关，说明肉品的品质与肉品的新鲜度密切相关，通过测定肉品鲜度指标可反映肉品质；TBARS 值与pH值、TVB-N 值及菌落总数呈显著相正相关，与感官品质呈显著负相关，说明TBARS 值也能很好的反应肉品质。另外，通过初步菌相分析得出，在0 ℃～4 ℃贮藏的条件下，保鲜盒包装冷鲜牛肉中的优势腐败菌有假单胞菌、热死环丝菌和乳酸菌。本研究为冷鲜牛肉生产企业提供一定的数据指导，也为屠宰过程中牛胴全表面减菌技术及冷鲜牛肉保鲜技术的研究提供一定的理论依据。