莫添麟 韦成威 韦志文

(1，广西河池市水产畜牧产品质量安全检验检测中心 547000；2，广西河池市金城江区动物疫病预防控制中心 547000)

近10年来，广西养猪业飞速发展，农村散养逐渐减少，规模化养猪已成为广西养猪的主要模式，但大量的种猪引进、频繁的生猪流通交易、部分规模化猪场不注意对疫病防控，导致圆环病毒2 型（PCV-2）成为危害广西规模化养猪的主要疫病，感染PCV2 不仅造成猪群免疫抑制，更容易导致混合感染，带来严重的经济损失[1-2]。猪圆环病毒（Porcine circovirus，PCV）属于圆环病毒科圆环病毒属，无囊膜，二十面体对称的单股负链DNA，是迄今已知的最小动物病毒[3]。基因大小约为2000bp，包含两个主要的开放阅读框[4]。目前，在病毒分类上将无致病性的PCV 命名为PCV1，而与断奶仔猪多系统衰竭综合征相关的PCV 命名为PCV2[5]。2015年美国学者从猪群中检测到一种能引起母猪皮炎肾病综合征与繁殖障碍的PCV3[6-7]。临床症状以新生仔猪先天性震颤、断奶仔猪多系统衰竭综合征、保育猪皮炎肾衰竭综合征、母猪以繁殖障碍综合征为主要症状。

猪链球菌病是由猪链球菌感染引起的一种人畜共患病，严重危害人和动物的健康。猪链球菌为一种有荚膜的革兰氏阳性球菌，具有一般链球菌属的特性，呈球形或卵圆形，单个、成对存在或呈短链形态存在，溶血性兼性厌氧菌。猪链球菌的菌体长短不一，大多数不能形成芽孢，无鞭毛，不能运动[8]。本病也是猪场的常发传染病之一，传播的主要方式是通过呼吸道感染。该病发病范围极广，我国各地区均有此病的感染报道，本病一年四季均可发生，但秋季和初冬发病率较高，大小猪均易感染，发病率和死亡率较高[9]。本病的临床症状主要为急性败血型、脑膜脑炎型、亚急性和慢性型。

1 材料

1.1 主要试剂

病毒 DNA/RNA 提取试剂盒 、Taq MasterMix、DL 1500 DNA Marker 购自北京康为世纪生物科技有限公司，琼脂糖凝胶购自西班牙GENE 公司。血平板培养基购自北京陆桥技术有限责任公司；微量生化反应管和药敏纸片购自杭州滨和微生物试剂有限公司。

1.2 样品来源

样品来源于2019年广西地区某规模化发病猪的脾脏、肺脏、淋巴结等病料样品。PCV2 阳性疫苗保存于广西兽医生物技术重点实验室。

2 方法

2.1 临床症状及剖检变化

病猪精神不振，体温升高，呼吸急促，后肢关节肿大，腹部、背部和臀部有红色隆起。对病死猪剖检可见，腹股沟淋巴结水肿，切面外翻多汁；肾脏肿大呈灰白色，肺间质增宽出血，心包积液内有豆腐渣样白色液体，脾脏有梗死灶，胃底黏膜出血，肠系膜出血，脑部有少量积液；关节肿大，切面有清亮液体流出。

2.2 细菌学检查

用无菌接种环取淋巴结、脾脏和肺脏样品，采用平板划线法，接种在血琼脂培养基平板上，置于37℃恒温培养箱中过夜培养18～24h 后观察，并进行细菌形态学观察及鉴定。

2.3 药敏试验

采用NCCLS [10]推荐的K-B 纸片法，选用青霉素类、头孢菌素类、氟喹诺酮类、氨基糖苷类等10 类共24 种常用抗菌药物进行体外药敏试验。

2.4 PCR 方法检测

2.4.1 组织样品RNA/DNA 提取

将病死猪脾脏、肺脏、淋巴结等病料样品放入研磨器中混合研磨，加入1.5ml 灭菌生理盐水，收集于2.0ml 的EP 管中，-70℃反复冻融3 次，8000r/min 离心5min，取上清液置于另一灭菌的 1.5ml 离心管中，12000r/min 离心 15min，取上清液，按病毒DNA/RNA 提取试剂盒说明提取组织样品的RNA/DNA。提取的病毒核酸-20℃保存备用。

2.4.2 引物设计

根据 GenBank 中报道的 PCV2 病毒株（PCV2 登录号DQ201639.1）全基因序列，进行 PCV2 检测。PCV2 检测引物为 PCV2-F（5'- CCGCGGGCTGGCTGAACTT-3'）和 PCV2-R（5'- ACCCCCGCC ACCGCTACC-3'），扩增长度 1154bp。引物由广州华大基因科技有限公司合成。

2.4.3 PCR 检测方法

PCV2 的反应体系为：2×Es Taq MasterMix 13μL，上游引物、下游引物各 1μL，DNA 模板 3μL，ddH2O 7μL，总反应体系 25μL。瞬时离心混匀，反应程序为 95℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min 30s ，35 个循环后，72℃再延伸 10min。

3 结果

3.1 细菌的分离鉴定

无菌采取送检病料的淋巴结、脾脏和肺脏样品于血琼脂培养基平板上，在淋巴结和脾脏均分离到细菌。经革兰氏染色镜检可看到革兰氏阳性球菌，多呈链状排列。进行生化试验发现，此病原菌可以将葡萄糖、乳糖、蔗糖、麦芽糖等发酵且不产气，但不能发酵棉籽糖和木糖，也不产生H2S 气体。经过以上鉴定可以确定为猪链球菌感染。

3.2 药敏试验结果

药敏试验结果显示，分离到的链球菌对头孢曲松钠、头孢拉定、头孢噻肟、阿莫西林、氨苄西林等高度敏感，对利福平、氧氟沙星、恩诺沙星、诺氟沙星、磺胺六甲钠等中度敏感，对氨曲南、克林霉素、林可霉素、呋喃唑酮、复方新诺明等不敏感。

3.3 PCV2 的 PCR 扩增结果

用RT-PCR/PCR 的方法对病料样品和阳性样品进行检测。阳性样品的片段大小在1154bp，鉴定表明该病料中PCV2 为阳性（见附图）。

4 预防治疗

及时隔离治疗发病猪，对病死猪和无治疗价值的猪采取无害化处理，防止病原扩散，对被污染的圈舍、场地和饲具进行严格彻底消毒。对病猪采用肌肉注射头孢噻呋、免疫球蛋白、转移因子，连用3～5d，对出现脑炎和关节炎的病猪同时肌注磺胺嘧啶钠，首次加倍，连用3～5d。未发病猪紧急接种猪圆环病毒2 型灭活苗和链球菌多价灭活苗。全猪群饲料中添加黄芪多糖、泰乐菌素，饮水中添加多维。

5 小结与讨论

通过实验室检测、临床症状、剖检分析，结果确诊为该病猪是由于猪圆环病毒和链球菌混合感染。圆环病毒2 型侵袭猪的单核吞噬细胞系统，是主要的免疫抑制性病原，导致猪群的免疫力下降，造成免疫失败，诱发其他疫病的发生。目前我国PCV2 的感染率居高不下，给我国养猪业造成巨大的经济损失。猪圆环病毒目前尚无特效药，疫苗接种是预防此病的有效手段，我国预防PCV2 的商品化疫苗主要是全病毒灭活疫苗、亚单位疫苗。猪链球菌一年四季均可发生，控制其传染的主要方法是加强饲养管理，提高猪群健康水平，加强猪场环境卫生，接种有效的疫苗。对于猪疾病的防治要根据不同的猪、不同的病、不同的发病情况进行具体分析，对症下药才能有效控制猪疾病，同时做好猪群健康保健工作是极其必要的。

附图 PCV2 的PCR 扩增电泳结果