姚 清，李润成，卿任科，廖华媛，余兴龙

（湖南农业大学动物医学院，湖南 长沙 410128）

猪链球菌（Streptococcus suis,SS）作为人畜共患病病原菌[1]，不仅能引起猪脑膜炎、心内膜炎、关节炎、败血症等，同时还能引起人患病。根据猪链球菌荚膜多糖抗原性的差异，已将猪链球菌分为33个血清型（1～31型，1/2型和 33型）[2]，以及一部分未定型菌株[3]。猪链球菌血清型分型调查是了解特定暴发流行病学，并监测潜在危险菌株的最有效方法之一，同时也是疫苗研发和免疫的重要参考资料。

不同血清型猪链球菌菌株致病力存在差异，引起临床发病的血清型也不同，因此在病猪及健康猪体内的分布也存在差异[4]，其中猪链球菌2型作为优势血清型，分布范围较广，致病性也较强[4]。据相关报道，2003—2007年从中国病猪中除分离到优势血清型猪链球菌2型（43.2%）外，还分离到了3型（14.7%）、4型、8型、5型、7型和 1/2型（3.2%～6.4%），其中SS3主要与肺炎的感染有关[5]。从法国患病和病死猪中分离到的主要血清型为2型、1/2型、9型、7型和3型[6]。在丹麦，血清型2型（29%）、7型（17%）、3、4和 8型（9%～10%）是最常分离到的血清型[7]。日本主要流行菌株为2型（28.2%），其次为 7型（10.8%）、1/2型（8.4%）、3型（7.4%）和 4型（5.5%）[8]。而韩国分离到的最主要血清型为3型（29%）和 4型（21%）[9]。因此，不同地区之间，猪链球菌的流行情况不同，优势血清型也存在差异。

1 材料与方法

1.1 样品

2015—2017年从湖南省部分猪场病猪群中收集疑似猪链球菌感染生猪的肺脏、关节、淋巴结、脾脏、脑组织、扁桃体、腹股沟淋巴结等脏器组织，共142份样本。

1.2 主要试剂

巧克力培养琼脂购于贝瑞特生物技术有限公司，DL 2 000 DNA Marker购于康为世纪生物科技有限公司，2×PCR Taq Mix、DNA提取试剂盒购于北京天恩泽基因科技有限公司。

1.3 引物合成

参考GenBank中登录的猪链球菌9型荚膜多糖基因序列（登录号为JX986798.1、BR001006.1、JF 273651.1、CP017142.1、CP015557.1、CP002644.1），设计猪链球菌9型引物，猪链球菌GDH鉴定引物参照文献[10]，其他血清型鉴定引物参照文献[11]，将引物送擎科生物技术有限公司合成。各引物信息见表1。

表1 猪链球菌各型引物信息

续表1 猪链球菌各型引物信息

1.4 细菌分离鉴定

（1）细菌分离与镜检用烧红的手术刀片将病料表面消毒，然后剪取一小块组织接种至巧克力营养琼脂上，置于37℃恒温箱中培养12 h后，挑取菌落形态较小、灰白色、透明或草绿色溶血环的疑似单菌落于巧克力营养琼脂上划线培养16 h，然后进行涂片镜检。

（2）疑似链球菌的PCR鉴定取疑似链球菌培养物，按DNA提取试剂盒操作说明提取DNA作为模板，采用猪链球菌GDH通用引物进行PCR鉴定，鉴定为猪链球菌者再用各血清型的特异性引物分别进行血清型的鉴定。PCR反应体系均为20 μL，包含10 μL mix，7 μL 蒸馏水，引物 2 μL，DNA 模板 1 μL。PCR反应条件均按94℃预变性5 min，94℃变性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，32个循环，72 ℃再次延伸7 min。PCR结束后1.0%琼脂糖凝胶电泳，紫外线灯下观察结果。

2 结果

2.1 细菌分离镜检结果

于过夜培养巧克力营养琼脂挑取疑似菌落增菌培养后进行革兰氏染色涂片镜检，能够观察到两个圆形结构连成的紫色短链状结构和长链状结构，疑似菌株代表性镜检见图1。

图1 疑似猪链球菌菌株代表型镜检

2.2 猪链球菌的GDH通用引物鉴定结果

对从142份样本分离的疑似链球菌。采用猪链球菌GDH引物进行PCR特异性扩增，结果共鉴定到猪链球菌GDH阳性菌株106株，代表性结果图片见图2。由图2可见除8、11号样本外，均扩增到了预期大小（657 bp）的特异性条带。

图2 猪链球菌GDH基因检测结果

2.3 猪链球菌各血清型鉴定

采用猪链球菌33个血清型引物对这106份阳性菌株进行PCR特异性扩增，各血清型部分鉴定结果见图3。

图3 猪链球菌各血清型PCR扩增结果

2015—2017年从湖南省部分猪场病猪群中采集肺脏、支气管、关节、淋巴结、脾脏、脑组织、扁桃体等，分离到106株猪链球菌，优势血清型为2型（30.19%），其次为 7型（11.32%）、8型（9.43%）和 3型（6.60%）等，其中未定型菌株所占比例较大，达13.21%，具体见表2。

表2 猪链球菌分型情况

3 讨论

2015—2017年从湖南省收集疑似猪链球菌感染病猪脏器142份，通过GDH基因的特异性PCR方法进行鉴定，共鉴定到猪链球菌菌株106株，分离率达 74.65%（106/142）。

通过CPS基因的特异性PCR方法进行猪链球菌分型鉴定，其中92株可以进行分型（分型率达86.79%），分别为 2型、3型、4型、6型、7型、8型、9型、12型、16型、18型、19型、20型、21型、30型以及14株未定型菌株。优势血清型为2型（1/2型）30.19%，这与国内外优势血清分离情况一致，说明2型分布范围广，致病性也较强，其次是7型（11.32%）、8型（9.43%）和3型（6.60%），这与国内[5,12-14]以及国外[6-9]优势血清型的分离情况有一致性，但是未分离到1型菌株，且3型所占比例与国内外分离情况相比偏低，这可能与空间、时间存在差异相关。

根据国家兽药基础数据库最新发布的信息，截至2019年1月初，国内已有6种商品化疫苗，分别为猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型），猪链球菌病灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型+猪链球菌7型），猪链球菌病蜂胶灭活疫苗（马链球菌兽疫亚种+猪链球菌2型），猪链球菌病灭活疫苗（2型，HA9801株），猪链球菌病、副猪嗜血杆菌病二联疫苗（LT株+MD0322株+SH0165株），猪败血型灭活疫苗（ST171株），主要是针对马链球菌兽疫亚种和猪链球菌2型、7型。2015—2017年湖南省部分病猪群中猪链菌的优势血清型除了2型与7型外，8型和3型的感染也较多，且3型的感染与肺炎有关，值得引起重视，本试验为今后猪链球菌疫苗的研究提供了参考数据。