邰晶晶，张玉斌*，吴仕達，李丙子，韩鋆，黄国业，余群力

1(甘肃农业大学 食品科学与工程学院，甘肃 兰州，730070)2(榆中兴业种养殖公司，甘肃 兰州，730070)

冷却肉销售期间，在无法感受其质地和气味的情况下，鲜肉具有的健康色泽成为消费者评价其品质的重要参考[1]。通常表面变色的鲜肉会切除表面加工成低价值的产品或以折扣价格出售，据美国肉类产业估计美国市场每年由于肉品变色造成的经济损失高达 10 亿美元，而由于肉品变色引起的肉类浪费对农业可持续性和环境的影响尚未确定[2-3]。因此，减少肉色劣变是肉类行业急需解决的问题。

乳酸盐在 2000 年被美国农业部规定为“一般认为安全”(generally recognized as safe，GRAS)的添加剂，在早期肉制品加工业中，乳酸钙、乳酸钾、乳酸钠3种不同阳离子的乳酸盐主要发挥其防腐抑菌作用[4]。在抑制某些病原菌方面，按重量计乳酸钾和乳酸钠所允许的最大用量为4%[5]。陈景宜等[6]对背最长肌、腰大肌和半膜肌3个部位牛肉的肉色稳定性进行了研究，发现影响肌肉肉色稳定性的生化因素有很多种情况，其中高铁肌红蛋白还原酶活性、NADH浓度和乳酸脱氢酶与肉色稳定性有显著的相关性。JOSEPH等[7]研究认为，从内在作用来看，向宰后肌肉中添加三羧酸循环中间代谢产物乳酸盐，会诱导肌肉再生NADH，而NADH可以提高高铁肌红蛋白还原和改善肉色稳定性。最近十年已有大量的研究者报道乳酸盐(注射增强)可影响肉色及其稳定性，但鲜见乳酸盐对于肉色调控机理的总结性报告和综述性文献。基于此，本文综述了乳酸盐对冷却肉的护色机理并概述相关研究进展，以期为冷却肉的护色提供参考。

1 肉色

自 1932 年Theorell首次将肌肉色素进行结晶，他发现肌红蛋白(myoglobin，Mb)不同于血红蛋白(hemoglobin，Hb)[8]。除放血不当外，肉色并不是由血红蛋白产生的，而是由肌红蛋白决定的，肉表面的色泽不仅取决于肌红蛋白的含量，还与肌红蛋白分子的化学状态、类型和其他成分的物理化学状态有关[9]。

1.1 肌红蛋白

肌红蛋白是一种复合蛋白质，相对分子质量在 17 000Da左右，是由1个血色素和1条多肽链构成的珠蛋白组成，血色素(铁卟啉)是由4个吡咯形成的环加铁离子所组成的，铁离子(亚铁状态/Fe2+，高铁状态/ Fe3+)位于环中央[10]，有 6条配位键，其中 4个与四吡咯环的N原子相连，另2个沿垂直于卟啉面的轴分布在环面的上下，其中第 5条与肌红蛋白肽链近端的 93 位组氨酸结合，剩下的第 6条键可以与不同配体分子结合，形成不同种类的肌红蛋白分子，进而影响肉色[11]。由此可见，铁离子化合价和血红素辅基的第 6位配体是肉色的决定因素[12]。

如果配位键结合氧气，铁离子的价态是还原态Fe2 +，为鲜红色的氧合肌红蛋白(oxymyoglobin，OMb)；但Fe2+不稳定，珠蛋白部分发生变性时氧结合能力下降，还原态氧氧化增强，容易氧化形成Fe3+，变成褐色的高铁肌红蛋白(metmyoglobin，MMb)[13]；如果铁离子配位键不连接任何其他分子并且为Fe2+时，便是紫红色的脱氧肌红蛋白(deoxymyoglobin，DMb)。此外，若第6位配体被一氧化碳(carbon monoxide,CO)占据，则会生成具有明亮桃红色的碳氧肌红蛋白(carboxymyoglobin，COMb)[14]，其中MMb的积累是造成肉色劣变的主要原因。

1.2 肌红蛋白的氧化还原态

肌肉中MMb的形成与氧分压有直接关系。鲜切肌肉在低氧分压(< 1.4 mm Hg)下表面主要为DMb，此时血红素辅基第 6位配体空缺，铁离子的价态为还原态Fe2+。在有氧环境下暴露 30 min后，血红素辅基第 6位被氧分子占据，中心的Fe2+被氧化成为Fe3+，鲜切肌肉表面形成鲜红色的OMb。与此同时，肌肉底部的DMb层向肉的中心延伸，由于氧分压很低甚至于无氧，所以继续保持DMb的状态[15]。随着在有氧环境下暴露时间的延长，肌肉内部的氧分压逐渐增大，肌肉表面的OMb层和内部的DMb层间会形成MMb层。若氧分压逐渐增大至 1.4～25 mm Hg时，MMb层厚度会逐渐增加并向表面移动，当肌肉表面 60% 的肌红蛋白以MMb存在时，肌肉就呈现褐色，造成肉色劣变[16]。影响MMb的形成的因素很多，总的来说主要有外在和内在两个方面，外在因素包括温度、氧分压和贮藏条件，内在因素包括pH以及其他呼吸过程对氧气的竞争[17]。

2 乳酸盐对肉色的影响机制

部分研究者认为乳酸盐在各个层次上的穿梭作用对还原型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NADH)和氧化型烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(nicotinamide adenine dinucleotide，NAD+)具有重要的调节作用，其所产生的还原力有助于MMb的还原[18]。过去十年大量学者已经广泛研究了乳酸盐在改善冷却肉色泽稳定性方面的有效性，KIM等[19]观察到用乳酸盐注射增强可以延缓肉品的变色速率，增加牛肉背最长肌和腰大肌的红度值(a*)；张玉斌等[20]通过在牛背最长肌肉糜中添加不同质量分数乳酸钙发现其均可有效抑制MMb的生成和脂肪氧化的发生，并显著提高肉色稳定性，其中0.3%的乳酸钙对稳定肉色有显著作用，护色效果明显。研究者认为乳酸盐主要通过3条途径来调控肉色：(1)通过与肌红蛋白直接作用影响肌红蛋白的氧化还原状态；(2)通过再生NADH减少MMb的积累；(3)通过抑制脂质氧化间接调控肉色。

2.1 乳酸盐与肌红蛋白的直接作用

Mb的氧化还原状态会直接影响肉色，作为一种氧的载体，它能响应线粒体对O2的需求，将O2从肌膜输送到线粒体，以促进各种代谢过程的进行，Mb一直被认为是非变构蛋白，在此情况下，肌肉中的O2含量迅速减少从而导致新陈代谢由有氧变成无氧酵解，产生乳酸[21]。研究者由此推测提高乳酸浓度可以激发建立一种防御机制，即Mb结构和功能的改变使得O2扩散到线粒体同时有氧呼吸产生能量。NAIR等[22]研究了关于Mb和乳酸盐的相互作用机理，通过体外模拟系统的结论指出，在pH为 5.6、 4 ℃ (肉品指标)和pH 7.4、 37 ℃(生理指标)条件下，当乳酸盐浓度为200 mmol/L时对二者体系内的氧化还原稳定性具有显著影响，其降低了MMb的含量，因此他们认为肉色稳定性的增加可能是由Mb与乳酸盐之间的相互作用而引起的。此外，MANCINI等[23]提出乳酸盐可直接作用于Mb从而提高肌肉色泽的稳定性，分析其作用机制，可能是通过以下2种机制来改变肌红蛋白的功能：(1)乳酸盐可以通过某种物理作用阻止氧气与血红素辅基的相互作用；(2)乳酸盐还可能诱导Mb的三级结构发生变化进而改变两者的结合途径。因此在添加了乳酸盐之后就会抑制Mb的氧化，同时显著降低MMb的形成，并且随着乳酸盐的浓度增加，MMb含量会显著降低(100～200 mmol/L)。

2.2 乳酸盐与NADH的再生

MMb的积累是造成肉色劣变的主要原因，影响MMb积累的主要有2个因素：肌浆中肌红蛋白的自动氧化速率和MMb还原的相对速率[24]。MMb的还原系统包括多个非酶系统和酶系统，主要是以MMb还原酶体系为主的酶促反应和以电子呼吸链为主的非酶促反应，这2种反应的还原活力总和称为MMb还原活力(metmyoglobin reduction activity，MRA)[25]。现在人们认为肉中的MMb还原主要是由于发生以NADH为辅酶的酶促和非酶促反应，也就是说NADH成为限制MMb还原的关键[26]。

乳酸盐作为糖异生的前体，可通过位于线粒体上不需氧的乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase，LDH)产生氢质子，产生的氢质子并不以氧作为直接的受氢体，而是以LDH的辅酶NAD+作为直接受氢体产生NADH和丙酮酸[27]。产生的丙酮酸经过丙酮酸脱氢酶生成乙酰辅酶A进入三羧酸循环产生能量， NADH可作为还原MMb的还原当量[28]，可将铁血红素还原为亚铁血红素，实现MMb的还原以改善肌肉颜色，有研究者将以乳酸盐为底物产生NADH的途径称为乳酸-LDH体系[29]。由于乳酸-LDH体系存在于线粒体，因此线粒体结构和功能的完整性至关重要，有研究表明在宰后 60 d的肌肉(真空包装)中仍可以分离出完整的线粒体，这说明在肌肉宰后线粒体会继续进行氧化代谢进而影响肌红蛋白的氧化还原状态[30]。RAMANATHAN等[31]认为乳酸盐具有充当线粒体呼吸系统底物的能力，由乳酸-LDH体系再生的NADH可以被用于线粒体中的还原酶体系和电子传递链从而介导MMb的还原，也就是说再生的NADH可通过酶促和非酶促两条途径实现MMb的还原，其中以酶促反应为主[32]。

2.2.1 酶促反应中NADH的再生途径

酶促还原MMb主要依赖于MMb还原酶系统，这些酶系统主要是MMb还原酶(metmyoglobin reductase，MMbR)[33]。MMb还原酶不是单独的一种酶类，而是一类与肉色有关酶类的统称，其主要包括线粒体上的细胞色素b5还原酶、肌质网上的细胞色素b等，这些酶类可以在一定条件下还原MMb，实现对肉色的稳定作用[34]。MMb还原酶主要位于线粒体，微粒体中也有少量存在，是一类NADH-依赖型还原酶类[35]。

目前的研究热点主要集中在NADH-细胞色素b5系统，此系统主要由线粒体膜中的细胞色素b5还原酶、细胞色素b5和NADH组成，其中外膜细胞色素b5还原酶主要位于线粒体，细胞色素b5位于微粒体中，所以是微粒体和线粒体一起控制MMb还原酶系统[36]。NADH-细胞色素b5催化MMb的还原主要与NADH含量有关，其具体的还原过程为： NADH作为电子供体，将电子传递至细胞色素b5还原酶，后者将电子转移给细胞色素b5，被还原的细胞色素b5再将电子传递到MMb的血红素辅基中，从而使Fe3+还原为Fe2+[37]。研究表明MMb还原酶的活性会随贮藏时间的延长逐渐降低，造成这种现象的主要原因是存在于线粒体中的NADH被耗尽[38]。乳酸盐作为三羧酸循环中间代谢产物可在线粒体中产生还原当量NADH，产生的NADH可通过穿梭作用在线粒体内外膜之间实现传递[39]。更加具体的说，外源添加的乳酸盐可通过乳酸盐的穿梭机制使胞质的乳酸盐通过MCT1(monocarboxy transporter 1，MCT1)转运到线粒体间膜空间，线粒体内的乳酸盐可通过乳酸-LDH体系再生NADH，再生的NADH使线粒体表面的NADH-细胞色素b5还原酶系统的反应得到补充，从而提高MMb的还原，达到稳定肉色的目的[40]。

2.2.2 非酶促反应中NADH的再生途径

MMb的非酶促还原反应主要是指线粒体氧化呼吸作用中的电子传递机制[41]，其调节机制为：线粒体膜中的复合物I(NADH-泛醌还原酶)、复合物Ⅱ(琥珀酸-泛醌还原酶)在氧化呼吸链中接受NADH反应后脱下的H+，并将脱下的H+传递给辅酶Q从而将H+释放于介质中，再经复合体 Ⅲ(泛醌-细胞色素c还原酶)、细胞色素c和复合体Ⅳ(细胞色素c氧化酶)将电子传递给MMb进而发生还原[42]。非酶促反应比酶促反应复杂的多，RAMANATHAN等[43]研究发现与对照组相比，乳酸钙处理组的NADH浓度增加，线粒体氧消耗增加，MMb的相对含量减少，其结论是乳酸盐再生的NADH可经过线粒体上的电子传递链，增加线粒体的氧消耗，降低氧分压，使线粒体对氧的竞争能力超过肌红蛋白，为MMb降低创造有利环境，使肌肉中存在大量DMb达到稳定肉色的作用。同时，创造的氧分压环境支持了电子传递链中电子的可用性，这些可用的电子能够通过在线粒体中存在的电子载体来减少肌红蛋白的氧化，改善肉色[44-45]。

2.3 乳酸盐与脂质氧化

脂质氧化是影响肉色劣变的原因之一，硫代巴比妥酸值的高低(thiobarbituric acid reactive substances，TBARS)可体现脂质氧化程度。CRUZEN等[46]对牛肉进行乳酸盐注射处理后发现，经乳酸盐注射增强的处理组其TBARS均低于对照组，研究者认为这主要是由于乳酸盐对超氧化物阴离子和羟自由基有清除作用，其可以在起始阶段抑制脂质过氧化物的产生[47-48]。

4-羟基壬烯醛(4-hydroxy-2-nonenal，HEN)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)是最具代表性的 2种脂质氧化产物。陈骋等[49]在pH值 5.6 和pH值 7.4 条件下通过向线粒体中添加脂质氧化的副产物MDA，发现NADH-依赖型MMb还原酶的活力分别下降了 48.97% 和 47.80%，这表明丙二醛能够抑制牛肉线粒体NADH-依赖型MMb还原酶的活力，从而降低MMb的还原速率加速肉色劣变。一些学者认为， HNE可以结合细胞色素c氧化酶和细胞色素c，而细胞色素c作为中间体，可以将电子从辅酶细胞色素c氧化还原酶(复合体Ⅲ)传递给细胞色素c氧化酶(复合体Ⅳ)，细胞色素c氧化酶能够将电子从细胞色素c传递给氧，从而降低线粒体的耗氧率，提高氧分压，增加肌红蛋白与氧的结合机率，促进肌红蛋白氧化[50]。此外，RAMANATHAN等[51]研究表明HEN通过降低乳酸-LDH体系中的乳酸脱氢酶活性减缓NADH的再生，从而使进入电子传递链的NADH减少，影响MMb的非酶促还原。以上研究进展说明脂质代谢产物主要通过影响线粒体上的酶系和电子传递链来调控MMb的还原，然而对于外源乳酸盐如何通过线粒体调控脂质氧化产物的产生进而影响肉色稳定性还需进一步研究。

3 展望

乳酸及其盐类作为绿色安全的添加剂以防腐和护色为目的已被大量用于肉制品加工业中，近十年的研究主要集中研究三羧酸循环的中间产物对肉色的影响，这些中间产物主要包括丙酮酸、乳酸盐、琥珀酸盐、和苹果酸。其中乳酸盐对肉色的调控主要借助乳酸盐的穿梭机制，通过乳酸-LDH体系再生NADH，再生的NADH可通过酶促和非酶促两条途径影响MMb的还原。此外，脂质氧化也是影响肉色劣变的原因之一，乳酸盐也可通过影响脂质氧化调控肉色。最近几年发现乳酸盐对肉色稳定性的改善并不是因为乳酸盐与肌红蛋白的直接作用，它可能通过线粒体机制来调节，因此从生化角度研究线粒体对于肉色稳定性的调节机制是下一步的研究重点。由于线粒体上存在有MMb还原酶系和大量中间代谢产物，可结合线粒体蛋白质组学研究乳酸盐对MMb酶系的影响，对蛋白质进行定性和定量研究。同时还可采用电子顺磁共振波谱技术、基质辅助激光解析电离飞行时间质谱等更为先进的分析测试手段和具有高通量、高灵敏、自动化、检测质量范围宽等优势的蛋白质组学研究技术，对线粒体内乳酸-LDH体系进行深入研究，以期更好地阐明宰后冷藏期间乳酸盐对肉品色泽稳定性的影响机制。