郑宗泰， 尹雷， 王鹏， 陈嘉伟， 林翰， 李炎稳， 周东△

1广东省人民医院(广东省医学科学院)神经外科(广东广州 510080)； 2广东省中医院脑病六科(广东广州 510120)

胶质母细胞瘤(glioblastoma，GBM)是最常见的原发性恶性中枢神经系统肿瘤(47.1%)和最常见的胶质瘤(56.1%)[1]。目前针对GBM的标准治疗方案为肿瘤尽可能最大范围安全切除，术后以Stupp方案治疗[2]。尽管通过积极的手术治疗和术后辅助治疗，GBM患者的预后仍然不容乐观，5年生存率仅为5.5%[1]。根据2016年WHO中枢神经系统肿瘤分类，分子生物学诊断技术已成为胶质瘤诊断的重要内容之一，并成为胶质瘤精准分类的基础，从而能更好地为患者制定个体化治疗方案和判断患者的预后[3]。我们应用免疫组织化学技术对GBM中O6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O6-methylguanine-DNA methyltransferase，MGMT)、表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、P53和Bcl-2进行检测，结合患者的临床特征和随访信息，探究GBM患者手术切除术后预后因素，为GBM治疗方法的选择提供客观依据，具有一定的指导意义。

1 资料与方法

1.1 一般资料 入组标准：(1)所有患者皆为首次患病；(2)开颅手术前未接受其他治疗；(3)术前无严重心、肝、肾脏等重要器官功能异常；(4)术后病理确诊为GBM；(5)随访资料齐全。2008年1月至2017年3月广东省人民医院(广东省医学科学院)手术切除的GBM患者139例，其中失访5例，术前外院接受伽马刀治疗3例，既往外院接受手术2例，最终128例符合入组标准纳入研究。该样本男88例，女40例，年龄13～77岁，平均(52.8±14.9)岁。所有患者采用全麻下开颅切除GBM，术前对患者行功能状态标准评分(Karnofsky performance score，KPS)和术前有无癫痫状态的评估，通过术前增强核磁共振判断肿瘤部位、肿瘤大小。肿瘤全切的定义为患者术后72 h的核磁共振T1增强像无残留的异常增强信号。

1.2 治疗方法 术后开始行辅助性化疗、放疗或同步放化疗。标准放疗方案：放疗总剂量为54～60 Gy，分割30次，每次剂量不超过2 Gy。标准化疗采用Stupp方案：替莫唑胺第1周期150 mg/m2，D1-5，每28 d重复；如能耐受，从第2周期起剂量可增加至200 mg/m2，常规循环6个周期，化疗期间附加减轻胃肠道反应药物。同步放化疗方案：采用标准放疗方式，同时每天口服替莫唑胺75 mg/m2，持续42 d。

1.3 免疫组织化学方法 鼠抗人MGMT单克隆抗体(1∶100)和鼠抗人EGFR单克隆抗体(1∶100)购自Origene公司，鼠抗人P53单克隆抗体(1∶1 000)和鼠抗人Bcl-2单克隆抗体(1∶200)购自Dako公司，鼠抗人VEGF多克隆抗体(1∶100)购自Biogenex公司。将GBM组织连续切片，免疫组织化学方法采用SP法，具体实验步骤根据说明书在Benchmark XT staining module(Ventana Medical Systems)上全自动进行。PBS液代替一抗作为阴性对照。细胞浆和(或)细胞核为棕黄色至深棕黄色且明显高于背景者为染色阳性细胞。所有指标高表达的评判标准：切片中5个高倍视野(×400)下阳性细胞率>10%(图1)。

1.4 随访方法 所有患者出院后都接受电话随访。以手术当天至有确切的影像学资料且依据RANO标准[4]提示患者GBM复发或随访截止日期跨度定义为无进展生存期，以手术当天至患者因GBM死亡或随访截止日期跨度定义为总生存期。平均随访时间为16.2(95%CI13.6～18.8)个月。

A：MGMT阳性；B：EGFR阳性；C：VEGF阳性；D：P53阳性；E：Bcl-2阳性；标尺= 50 μm

1.5 统计学方法 使用SPSS 19.0统计软件进行统计分析。首先使用Kaplan-Meier法进行单因素分析，以总生存期和无进展生存期为因变量，分别检验临床变量和免疫组化指标对患者预后的影响，并制作生存曲线；同时使用Log-rank进行组间差异显著性比较。对单因素分析有统计学意义的因素进行Cox比例风险模型分析(输入法)，并计算每个变量的比值比(odds ratio，OR)及其95%CI。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 患者基本资料 128例患者中术前出现癫痫有30例(23.4%)，术中完全切除肿瘤和完成Stupp治疗方案的分别为76例(59.4%)和67例(52.3%)。到随访截止日期，肿瘤复发和因胶质瘤死亡分别为81例(63.3%)和112例(87.5%)，见表1。中位总生存期为11.2(95%CI9.9～12.5)个月，平均总生存期为18.6(95%CI15.1～22.0)个月，中位无进展生存期为6.1(95%CI5.4～6.8)个月，平均无进展生存期为13.3(95%CI10.0～16.5)个月。截止至随访结束，共有112例患者因GBM死亡，他们的平均总生存期为13.5(95%CI11.2～15.8)个月。

2.2 单因素分析结果 患者年龄、术前KPS、肿瘤切除程度和术后是否同步放化疗对总生存期和无进展生存期都有影响(P<0.05)；同时，肿瘤的MGMT和EGFR表达分别对患者的总生存期和无进展生存期有影响，差异有统计学意义(P<0.05)。患者性别、术前有无癫痫、肿瘤部位、肿瘤体积以及VEGF、P53和Bcl-2的表达对患者的总生存期和无进展生存期无统计学意义上的影响(P>0.05)。见表2。

表1 128例GBM患者临床特征

表2 GBM患者无进展生存期和总生存期的单因素分析结果

2.3 多因素分析结果 Cox比例风险模型分析结果显示，患者年龄、术前KPS评分、肿瘤切除程度、术后是否进行同步放化疗以及MGMT的表达是总生存期的独立影响因素(P<0.05)；同时，患者年龄、肿瘤切除程度、术后是否进行同步放化疗以及EGFR的表达是无进展生存期的独立影响因素(P<0.05)。见表3。

2.4 MGMT在同步放化疗患者的预后价值 本研究进一步探究MGMT的表达对术后完成放化疗患者的预后价值。结果显示，MGMT高表达的患者的总生存期比MGMT低表达的患者的总生存期更短，差异有统计学意义(P=0.034)。然而，两组在无进展生存期上无明显差异(P=0.310)。

表3 GBM患者无进展生存期和总生存期的多因素分析结果

3 讨论

本研究旨在分析GBM患者的临床特征和免疫组化结果，探究这些变量尤其是免疫组化的结果对预后判断的价值，从而指导临床治疗，最大程度延长患者生存期。本研究单因素和多因素生存分析皆提示患者的年龄越小、肿瘤全切、术后进行同步放化疗皆有利于延长患者的总生存期和无进展生存期，另外术前KPS是无进展生存期的独立影响因素。该结果与国内外文献[5-9]报道一致。患者术前较好的身体状况使其可以耐受手术尤其肿瘤全切的手术以及术后放化疗带来的不良反应。年龄方面，随着患者年龄增长，其身体状况越差，耐受手术的能力下降，接受肿瘤全切的可能性越小，本研究证实年龄较大组(≥ 53岁，53.5%)接受全切的比例相比年龄较小组(<53岁，66.7%)的低；并且术后恢复相对缓慢且效果不理想，接受术后放化疗的可能性相对较小，本研究证实年龄较大组(≥ 53岁，47.8%)接受同步放化疗的比例相比年龄较小组(<53岁，62.5%)的低。因此患者年龄越大，其预后相对越差，即无进展生存期和总生存期越短。术后接受放化疗治疗可以有效杀死残余的肿瘤细胞，延长患者的无进展生存期，进而延长患者的总生存期。

替莫唑胺作为一种烷化剂能将烷基引入DNA骨架多个位置从而阻碍DNA的复制，诱发凋亡。而MGMT编码的一种DNA修复蛋白能迅速逆转DNA的烷基化，修复DNA的碱基结构从而阻止替莫唑胺诱导的细胞凋亡，最终导致肿瘤细胞对替莫唑胺耐药。MGMT启动子甲基化使其无法编码DNA修复蛋白，提高胶质瘤对替莫唑胺的敏感性，从而改善化疗患者的预后[7，10]。本研究虽然没有对MGMT启动子甲基化的进行检测，但已有研究证明MGMT基因启动子甲基化状态与MGMT蛋白低表达相关[11-12]，MGMT启动子甲基化可能引起MGMT蛋白的表达受抑制，进而抑制DNA修复蛋白的作用使得肿瘤细胞对替莫唑胺敏感。有趣的是，也有报道说MGMT启动子甲基化能增加胶质瘤的放疗敏感性[13]。MGMT启动子甲基化能预测患者的预后已得到多项研究的支持[7-8，10，14]，但MGMT蛋白表达是否有同样效应仍存在争议[7，11，14]，这可能与MGMT蛋白的检测方式、染色评分标准、样本量有限和患者入组标准不同有关。本研究多因素生存分析结果表明，MGMT高表达的患者其总生存期较低表达患者明显缩短，差异有统计学意义，说明MGMT的蛋白表达能有效预测GBM患者的预后。为了探索MGMT的免疫组化表达对同步放化疗敏感性的预测能力，本研究还进一步对比MGMT高表达和低表达患者在术后接受同步放化疗后的无进展生存期和总生存期。67(52.3%)例患者术后完成了同步放化疗。在这类患者中，MGMT低表达的患者的总生存期比高表达患者明显延长，说明MGMT的蛋白表达能预测胶质瘤对同步放化疗的敏感度以及患者的预后。因此，对于术后免疫组化提示MGMT低表达的患者，为有效延长其生存期，应当积极地进行同步放化疗。

EGFR作为一种跨膜蛋白受体，既有调控正常细胞增殖、分化与凋亡的功能，也参与了肿瘤细胞的血管发生、侵袭和转移等[15]。该基因的突变和扩增分别占GBM的9.2%和27%，说明其在GBM的形成和发展过程中有重要作用[16-17]。在本研究里，EGFR高表达的患者占了68%，并且EGFR高表达的患者(89.4%)相比低表达的患者有更大的比例出现肿瘤复发(75%)。多因素分析结果显示，EGFR高表达是GBM患者手术切除术后复发的独立危险因素。影响GBM患者预后的决定性因素是肿瘤的复发，而GBM术后复发的比例相当高，在本研究截止随访日期时达到了63.3%。国内外的研究表明，GBM患者在肿瘤复发后进行二次手术甚至多次手术皆有利于延长患者的生存期[9，18]。因此，EGFR高表达的患者因为有更高的肿瘤复发风险，为延长肿瘤的复发时间以及改善预后，应定期影像学复查，医生也应更为密切地随访此类患者，以早期发现肿瘤的复发，为二次手术甚至多次手术争取时间和空间。

P53基因包括野生型和突变型两种形式。野生型P53是抑癌基因，在DNA损伤或缺氧时活化可通过阻断细胞周期或者促使细胞凋亡来抑制癌症，有利于肿瘤患者的预后。突变型P53基因失去了抑癌功能，导致细胞无限增生，最终形成恶性肿瘤，与肿瘤患者预后呈负相关。在蛋白表达方面，突变型的P53蛋白相比野生型的P53蛋白半衰期长，因此在免疫组化表达上呈现高表达[19]。并且P53蛋白表达水平与胶质瘤的恶性程度呈正相关[20-21]。然而，在本研究的单因素生存分析中，P53高表达患者相比低表达患者的总生存期和无进展生存期没有明显差异。我们认为可能本研究的样本量相对有限，导致一些相对细小但有统计学意义的差异无法被检验出来，未来有必要扩大样本量进一步验证P53蛋白表达与患者预后的关系。在一篇涉及1322个中国胶质瘤患者的Meta分析中，P53的免疫组化表达不仅被证实与胶质瘤的WHO级别呈正相关，还与胶质瘤患者的1年、3年和5年总生存期有关，P53的免疫组化表达能有效地预测患者的预后[21]。

同P53一样，本研究也未能证明VEGF和Bcl-2在GBM患者存在预后价值，虽然已有Meta分析证实VEGF的免疫组化表达能预测患者的预后[22]。或许更多的样本量、更为有效的检测手法可以更好地探究它们的预后价值。

综上所述，影响GBM患者预后的因素除了年龄、术前KPS、肿瘤切除程度、术后同步放化疗外，MGMT和EGFR的表达也能预测患者的预后，并且MGMT高表达的患者接受同步放化疗有利于延长生存期。为改善患者预后，对于MGMT低表达的患者，因其对放化疗敏感，应积极地行同步放化疗以改善预后；对于EGFR高表达的患者，因其有更高的肿瘤复发风险，应定期影像学复查并对其密切地随访以早期发现肿瘤的复发早期治疗。