高国栋， 张庆云， 易利， 李岩

天津市蓟州区人民医院 1预防保健部, 2泌尿外科(天津 301900)

前列腺癌是主要发生于中年和老年男性的恶性肿瘤，在全世界的发病率为25.3/10万，位于男性所有恶性肿瘤的第2位[1]。富含半胱氨酸蛋白61(cysteine-rich angiogenic inducer 61，Cyr61)是一种含有丰富半胱氨酸的分泌型基质蛋白质，由即刻反应基因编码，在CCN家族中第一个被发现，又被称为CCN1[2-3]。Cyr61具有广泛的生物学功能，在组织再生、胚胎发育、炎症、肿瘤等生理病理过程中发挥重要的调节作用。研究发现，与正常前列腺组织相比较，前列腺癌中Cyr61的表达水平发生变化，但是关于其变化趋势的研究结果尚未统一，如Pilarsky等[4]发现Cyr61蛋白可在正常前列腺组织的上皮细胞中表达，而前列腺癌组织中Cyr61蛋白的表达明显降低；D′Antonio等[5]则发现前列腺癌和前列腺上皮内瘤中Cyr61蛋白的表达均显著升高。Cyr61在前列腺癌中表达的变化仍有待研究，其作用机制尚不清楚，因此本研究旨在探讨Cyr61在前列腺癌组织中的表达及其对前列腺癌细胞增殖、上皮间质转化和自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 主要试剂 人前列腺癌PC-3细胞购于中国科学院上海细胞库；山羊血清封闭液、DAB显色液、苏木素、DAPI购于北京中杉金桥；RPMI 1640培养基、胎牛血清、青霉素、链霉素购于Gibco公司；Lipofectin-2000TM购于Invitrogen公司；序列合成于上海生工；抗Cyr61抗体、抗E-钙黏蛋白(E-cadherin)抗体、抗波形蛋白抗体、抗LC-3Ⅱ抗体购于Santa Cruz公司；抗p-PI3K抗体、抗p-AKT抗体、抗GAPDH抗体购于Abcam公司；二抗购于武汉博士德；Trizol购于Solarbio公司；PrimeScriptTMRT reagent Kit with gDNA Eraser逆转录试剂盒、荧光定量PCR试剂盒购于Takara公司；MTT、PMSF、RIPA裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、上样缓冲液、ECL显色液购于上海碧云天。

1.2 组织的获取与检测 选取2016年5月至2018年9月期间于我院进行手术治疗的47例前列腺癌患者作为研究对象，所有患者均经组织病理学确诊，排除术前已行放化疗治疗者、合并肝肾功能障碍或其他系统疾病者。一般资料：均为男性；年龄(68.25±6.74)岁；确诊时平均前列腺特异性抗原(prostate specific antigen，PSA)含量为(8.36±3.09)ng/mL；Gleason评分：高分化组(<7分)12例、中分化组(7～8分)25例、低分化组(>8分)10例。

收集手术切除的前列腺癌组织和癌旁正常组织，留取部分组织液氮速冻后保存于-80℃，以进行蛋白质免疫印迹试验(Western blot，WB)和荧光定量聚合酶链式反应(quantitative real time polymerase chain reaction，RT-PCR)；其余组织置于4%多聚甲醛中固定，以进行免疫组织化学染色。

1.3 免疫组织化学染色 将4%多聚甲醛固定后的前列腺癌组织用石蜡包埋，切成厚度约为5 μm的切片，将切片放置于60℃恒温箱中1 h以融化组织表面的蜡，常规脱蜡和水化，使用3%的H2O2溶液灭活内源性的过氧化氢酶，将切片放于0.01 mol/L的枸橼酸钠缓冲液中进行微波修复，10%的山羊血清封闭液室温封闭20 min，滴加抗Cyr61抗体(1∶100)4℃过夜孵育。洗涤3次后，滴加二抗37℃孵育30 min，洗涤3次，滴加DAB显色液，自来水冲洗干净后进行苏木素复染，最后经脱水、透明、树胶封片后进行镜检和拍照。

1.4 质粒的构建和转染 参照付鹏等[6]的研究合成Cyr61的小干扰RNA (siCyr61)和无关序列 (siControl)，见表1。将上述单链寡核苷酸片段用退火缓冲液溶解，95℃水浴退火5 min以形成双链，使用基因工程的方法将其构建至pGenesil-1.1质粒的BamHⅠ酶切位点和HindⅢ酶切位点间，DNA测序验证序列是否正确。使用Lipofectin-2000TM将测序正确的siControl质粒和siCyr61质粒转染至PC-3细胞，分别使用qRT-PCR和WB检测细胞中Cyr61 mRNA和蛋白的表达。

表1 小干扰RNA的序列

1.5 细胞培养和分组 将PC-3细胞培养于含有10%胎牛血清、1%青链霉素的RPMI 1640培养基，置于37℃、5%CO2的细胞培养箱中进行常规培养。将PC-3细胞随机分为3组，分别为空白组、siControl组和siCyr61组。siControl组使用siControl质粒进行转染，siCyr61组使用siCyr61质粒进行转染，空白组使用PBS作为转染对照。

转染48 h后，使用qRT-PCR检测细胞中Cyr61 mRNA的表达，使用WB检测细胞中Cyr61、E-cadherin、波形蛋白(Vimentin)、p-PI3K、p-AKT蛋白的表达，使用免疫荧光染色检测细胞中LC-3Ⅱ的表达。使用MTT试验检测转染后24 h、48 h和72 h时的细胞增殖情况。

1.6 免疫荧光染色 将PC-3细胞以每孔2×104个细胞接种至24孔板，按照上述方法将细胞随机分为空白组、siControl组和siCyr61组，并进行相应的转染。转染48 h后，吸弃上清液，洗涤细胞，使用抗LC-3Ⅱ抗体(1∶50)4℃过夜孵育。洗涤后，加入偶联FITC的山羊抗兔二抗，室温避光孵育1 h，洗涤后，加入DAPI溶液室温避光孵育30 min，洗涤，荧光显微镜下观察和拍照。

1.7 MTT检测细胞增殖 将PC-3细胞以每孔4×103个细胞接种至96孔板，按照上述方法将细胞随机分为空白组、siControl组和siCyr61组，并进行相应的转染。转染后24、48和72 h时，吸弃培养液，PBS洗涤后加入180 μL的无血清培养液和20 μL的MTT溶液(5 mg/mL)，继续于37℃培养4 h，吸弃培养液后每孔加入150 μL的DMSO，震荡10 min，使用酶标仪于490 nm波长下测定各孔的光密度值(OD值)。

1.8 荧光定量聚合酶链式反应 使用RT-PCR检测前列腺癌组织和癌旁组织中Cyr61 mRNA的表达，使用RT-PCR检测空白组、siControl组和siCyr61组PC-3细胞中Cyr61 mRNA的表达。Trizol法提取组织和细胞中的总RNA，将其逆转录为cDNA，然后进行PCR扩增，反应条件：94℃预变性5 min；94℃变性1 min,58℃退火1 min，72℃延伸30 s，共35个循环。取扩增产物进行2%的琼脂糖凝胶电泳，凝胶成像仪下观察和拍照。使用Quantity One软件测定各条带的灰度值，将目的基因与内参基因GAPDH的灰度值之比作为1。

所用引物为：Cyr61上游引物：5′-CTCGCCTTAGTCGTCACCC-3′，下游引物：5′-CGCCGAAGTTGCATTCCAG-3′；GAPDH上游引物：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，下游引物：5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′。

1.9 蛋白质免疫印迹 使用WB检测前列腺癌组织和癌旁组织中Cyr61蛋白的表达，使用WB检测空白组、siControl组和siCyr61组PC-3细胞中Cyr61、E-cadherin、Vimentin、p-PI3K和p-AKT的表达。加入含有1 mmol/L PMSF的RIPA裂解液充分裂解细胞和组织，组织需要同时进行匀浆才可充分裂解，12 000×g离心5 min，取上清液进行BCA蛋白定量。取40 μg的总蛋白，加入上样缓冲液后，沸水中煮5 min，以充分变性，然后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，将目的蛋白转印至PVDF膜。5%的牛血清白蛋白室温封闭2 h，加入抗Cyr61抗体(1∶500)、抗E-cadherin抗体(1∶1 000)、抗Vimentin抗体(1∶1 000)、抗p-PI3K抗体(1∶500)、抗p-AKT抗体(1∶500)和抗GAPDH抗体(1∶3 000)4℃过夜。洗涤3次，加入二抗(1∶5 000)室温孵育1 h，洗涤3次，滴加ECL显色液，凝胶成像仪下观察和拍照。使用Image Pro Plus 6.0软件测定各条带的灰度值，将目的蛋白与内参蛋白GAPDH的灰度值之比作为1。

1.10 统计学方法 使用SPSS 20.0统计软件，所有计量数据均表示为均数±标准差，3组间计量数据的比较使用单因素方差分析，两组间计量数据的比较使用t检验。以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 免疫组化检测Cyr61在前列腺癌组织中的表达 Cyr61在前列腺癌旁组织中呈阴性或低表达，而在前列腺癌组织中的表达水平明显升高，显示为棕黄色颗粒，见图1。

A：癌旁组织; B：前列腺癌组织

2.2 RT-PCR和WB检测前列腺癌组织中Cyr61 mRNA和蛋白质的表达 与癌旁组织相比较，前列腺癌组织中Cyr61 mRNA和蛋白质的表达水平升高，差异有统计学意义(P<0.05)，见图2和表2。

A:RT-PCR检测；B:WB检测

表2Cyr61mRNA和蛋白质在前列腺癌组织和癌旁组织中表达的比较

项目例数Cyr61 mRNACyr61蛋白质癌旁组织471.00±0.211.00±0.18前列腺癌组织473.73±0.693.05±0.54t值25.95024.690P值<0.001<0.001

2.3 RT-PCR和WB检测人前列腺癌细胞中Cyr61 mRNA和蛋白质的表达 与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞中Cyr61 mRNA和蛋白质明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图3和表3。

2.4 沉默Cyr61对人前列腺癌细胞增殖的影响 与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞在培养24、48、72 h时OD值明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见表4。

A:RT-PCR检测；B:WB检测

表33组细胞中Cyr61mRNA和蛋白质表达的比较

项目nCyr61 mRNACyr61蛋白质空白组101.00±0.221.00±0.16siControl组101.04±0.240.93±0.20siCyr61组100.23±0.11∗△0.29±0.14∗△F值52.95053.910P值<0.001<0.001

*与空白组比较P<0.05；△与siControl组比较P<0.05

2.5 沉默Cyr61对人前列腺癌细胞上皮间质转化的影响 与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞中E-cadherin的表达明显升高，Vimentin的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图4和表5。

表43组细胞间细胞增殖的比较(OD值)

项目n24 h48 h72 h空白组100.493±0.0290.872±0.0451.406±0.110siControl组100.487±0.0340.880±0.0561.413±0.122siCyr61组100.328±0.031∗△0.562±0.033∗△0.774±0.051∗△F值88.810157.800136.500P值<0.001<0.001<0.001

*与空白组比较P<0.05；△与siControl组比较P<0.05

图4 WB检测PC-3细胞上皮间质转化相关蛋白的表达

2.6 沉默Cyr61对人前列腺癌细胞自噬的影响 与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞中LC-3Ⅱ的荧光强度较高，见图5。

项目nE-cadherinVimentin空白组101.00±0.241.00±0.21siControl组100.96±0.201.05±0.27siCyr61组102.75±0.46∗△0.28±0.13∗△F值101.40041.590P值<0.001<0.001

*与空白组比较P<0.05；△与siControl组比较P<0.05

图5 免疫荧光染色检测PC-3细胞LC-3Ⅱ的表达(×200)

2.7 沉默Cyr61对PI3K/AKT信号通路的影响 与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞中p-PI3K和p-AKT的表达明显降低，差异有统计学意义(P<0.05)，见图6和表6。

3 结论

Cyr61是CCN家族的细胞外基质相关蛋白，具有促进细胞增殖、黏附、迁移、血管生成、肿瘤生长、胚胎发生等广泛作用。研究发现，Cyr61蛋白过量表达于乳腺癌、卵巢癌、结肠癌、胰腺癌、胶质母细胞瘤等多种类型肿瘤，可作为潜在的预后指标和治疗靶点，但是其在子宫肌瘤、非小细胞肺癌等部分肿瘤中却表达下调，上调Cyr61表达能够抑制肺癌细胞的生长[7-8]。Cyr61在前列腺癌中的相关报道也有很多不一致之处，如Terada等[9]认为Cyr61在前列腺癌患者的血清和组织中高表达，其血清中含量的测定可用于判断前列腺癌患者的预后；而Lee等[10]却发现在N-乙酰半胱氨酸抑制前列腺癌PC-3细胞增殖的实验中伴随着Cyr61表达的显著升高。因此，Cyr61在前列腺癌中的表达变化和具体作用需要进一步研究。

图6 WB检测PC-3细胞PI3K/AKT信号通路相关蛋白的表达

项目np-PI3Kp-AKT空白组101.00±0.221.00±0.19siControl组100.97±0.201.07±0.23siCyr61组100.31±0.14∗△0.26±0.10∗△F值42.25061.040P值<0.001<0.001

*与空白组比较P<0.05；△与siControl组比较P<0.05

本文收集了手术切除的前列腺癌组织和癌旁正常组织，对组织中Cyr61的表达进行免疫组化染色，结果显示Cyr61在前列腺癌旁组织中呈阴性或低表达，而在前列腺癌组织中则呈棕黄色的阳性表达。RT-PCR和WB的结果也显示前列腺癌组织中Cyr61 mRNA和蛋白质的表达量较癌旁组织升高。因此，本文认为Cyr61在前列腺癌患者的癌组织中高表达，部分报道与本研究结果不一致的原因可能在于样本来源、检测指标、样本数量等不同。

本文将构建的Cyr61干扰序列和对照序列转染至人前列腺癌PC-3细胞，结果显示细胞中Cyr61 mRNA和蛋白质明显降低，表明Cyr61的小分子干扰RNA构建成功。MTT试验结果显示，与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞在培养24、48和72 h时OD值明显降低，表明Cyr61沉默后可以抑制人前列腺癌PC-3细胞的增殖。Cyr61对大部分细胞均具有促增殖效应，如Cyr61可以通过整合素αⅤβ3受体促进乳腺癌细胞增殖，增强化疗药物抵抗[11]。但是Cyr61对部分细胞也具有抑制效应，如Cyr61可以与成纤维细胞的整合素α6β1受体结合，诱导p53依赖的细胞凋亡[12-13]。因此，本文认为Cyr61对不同细胞生物学效应的差异性可能与细胞类型以及作用受体有关。

上皮间质转化指上皮细胞逐渐失去上皮特性，并且获得间质特征，迁移和侵袭能力增强，是肿瘤转移过程中关键的起始过程。大量研究证实，上皮间质转化参与前列腺癌的迁移和侵袭，靶向抑制上皮间质转化中关键的信号通路具有良好的肿瘤治疗效应[14]。E-cadherin是上皮细胞的标志物，波形蛋白是间质细胞的标志物，它们表达水平的变化可以反映上皮间质转化的程度[15]，因此本文对这两个分子的表达进行检测，结果显示与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞中E-cadherin的表达明显升高，波形蛋白的表达明显降低，表明Cyr61沉默可以抑制前列腺癌细胞的上皮间质转化。

自噬是一种细胞降解途径，主要表现为在炎症、饥饿、生长因子剥夺等应激环境下，细胞器等成分被吞噬、消化、再循环以维持细胞的新陈代谢，也参与病原体清除、凋亡细胞吞噬等病理过程。自噬水平的下调可以促进前列腺癌细胞的生长，使用药物等方法上调自噬水平可以诱导细胞死亡[16-17]。LC-3Ⅱ是自噬的标志物[17]，因此本文对LC-3Ⅱ的表达进行免疫荧光染色，结果显示与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞中LC-3Ⅱ的荧光强度较高，表明Cyr61沉默可以诱导LC-3Ⅱ的表达，上调自噬水平。

PI3K/AKT信号通路的激活在前列腺癌发生发展中发挥重要作用，参与细胞周期的调节、凋亡的抑制、血管形成、迁移和侵袭等，抑制PI3K/AKT信号通路可以降低前列腺癌细胞的增殖、迁移和侵袭能力，增强化疗药物治疗的敏感性[18]。本文结果显示，与空白组和siControl组相比较，siCyr61组细胞中p-PI3K和p-AKT的表达明显降低，表明Cyr61沉默可以抑制PI3K/AKT信号通路，可能是Cyr61沉默抑制前列腺癌细胞生长的机制。

本研究的不足：(1)作为一种促血管生成因子，Cyr61诱导的血管生成在各种肿瘤的形成与进展中发挥重要的病理作用[19]，但是本研究未对Cyr61在前列腺癌血管生成中的作用进行探讨；(2)上皮间质转化可使肿瘤细胞获得更强的侵袭性，本研究发现Cyr61沉默可以降低上皮间质转化相关蛋白的表达，但是Cyr61是否进一步影响前列腺癌细胞的迁移和侵袭能力尚不清楚；(3)本研究使用体外细胞学实验探讨Cyr61在前列腺中的作用，但是相关结论尚缺乏体内动物学实验验证。

综上所述，Cyr61在前列腺癌患者的癌组织中高表达，使用RNA干扰将Cyr61沉默后可以抑制人前列腺癌PC-3细胞的增殖，降低上皮间质转化相关蛋白的表达，促进自噬的发生，可能与对PI3K/AKT信号通路的抑制有关。