李宁宁， 唐毅， 黎璞， 熊之璋， 黄隽， 苏榕△

广州医科大学附属第三医院 1乳腺外科， 2妇科(广东广州 510150)

乳腺癌是中国女性发病率居首位的恶性肿瘤，2014年新增病例27.89万例[1]，发病年龄比西方国家提前10年以上，其中确诊时年龄<50岁者超过50%，这意味着许多患者还未生育，并希望在诊断乳腺癌后妊娠、分娩，而世界范围内新增乳腺癌患者仅25%未绝经[2]。化疗作为乳腺癌的主要治疗方法可导致卵巢功能衰竭[2]，早期乳腺癌5年生存率80%～90%[3]，尽管这些患者长期生存，但面临不孕的巨大风险，严重影响年轻乳腺癌患者，特别是未生育患者的生活质量。目前证据尚未发现乳腺癌幸存者生育会造成复发转移风险增加，也未发现出生婴儿缺陷率增加，近年育龄期乳腺癌患者生育功能保护问题也日益引起重视[4-5]。抗苗勒管激素(anti-Müllerian hormone，AMH)是一项反映女性卵巢储备功能(ovarian reserve，OR)灵敏准确的血清学指标，可反映卵巢原始卵泡池大小，在月经周期中保持较恒定的水平[6]。使用AMH评估乳腺癌患者卵巢储备功能的研究在国内尚未见报道。本研究对绝经前乳腺癌患者化疗期间及随访期内AMH及常规指标雌二醇(E2)、卵泡刺激素(FSH)进行动态监测，记录化疗诱导闭经(chemotherapy-induced amenorrhea，CIA)及月经恢复情况，探讨CIA及化疗后残存卵巢储备功能的预测指标，为早期识别卵巢储备功能降低的育龄期乳腺癌患者提供依据，便于其及时获得生育咨询。

1 资料与方法

1.1 纳入和排除标准 2016年2月至2017年9月广州医科大学附属第三医院乳腺外科收治的乳腺癌患者，纳入符合以下所有条件者：(1)原发性可切除无远处转移的乳腺癌患者；(2)入组前有规律月经至少3个周期；(3)拟行化疗方案包含环磷酰胺。如符合以下任一项条件予排除：(1)既往或治疗过程中行子宫切或卵巢切除术； (2)既往或治疗过程中患卵巢肿瘤；(3)既往接受化疗；(4)入组前30 d内使用过性激素避孕药；(5)妊娠期；(6)使用促性腺激素释激素类似物。研究经伦理委员会批准，患者签署知情同意书。

1.2 研究方法 本研究为前瞻性队列研究，记录患者年龄、体质指数、治疗前后月经状态、病理结果及化疗方案。CIA定义为化疗后停经至少持续6个月。月经恢复的定义为：出现CIA的患者在化疗结束后随访期内恢复规律阴道出血。分别于化疗前、化疗1周期后及化疗结束后3周内及化疗完成后6月共4个时间点检测入组患者血清激素水平。血清AMH水平采用酶联免疫法，AMH定量检测试剂盒(KR-AMH-001，康润生物科有限公司，广州)， 最低检测限量为0.06 ng/mL，室内质控变异系数3%～5%。血清FSH检测采用化学发光微粒子免疫检测法(CMIA)，FSH测定试剂盒(7K75 Abbott Ireland Diagnostics Division)，最低检测限量为0.05 IU/L，室内质控变异系数<5%。血清E2检测采用CMIA法，E2测定试剂盒(7K72，Abbott Ireland Diagnostics Division)最低检测限量为10 pg/mL，室内质控变异系数<7%。

1.3 统计学方法 采用SPSS 22.0 统计软件，重复测量计量资料采用方差分析，不符合正态分布、方差齐性或存在异常值时使用非参数检验，相关性分析采用Spearman秩相关分析，以P<0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般情况 共纳入40例绝经前乳腺癌患者，化疗前年龄26～50岁，平均(41.60±6.59)岁，体质指数15.6～27.1 kg/m2，平均(22.78±2.98)kg/m2，33例ER/PR阳性并接受他莫昔芬治疗，7例ER/PR均阴性。15例HER-2 阳性患者中用12例使用曲妥珠单抗。化疗方案包括:(1)EC-D(累计环磷酰胺2 000 mg/m2、表阿霉素360 mg/m2、多西他赛320 mg/m2)；(2)ddEC-P(累计环磷酰胺2 000 mg/m2、表阿霉素360 mg/m2、紫杉醇700 mg/m2)；(3)EC-wP(累计环磷酰胺2 000 mg/m2、表阿霉素360 mg/m2、紫杉醇960 mg/m2)；(4)TEC(累计环磷酰胺3 000 mg/m2、表阿霉素540 mg/m2、多西他赛450 mg/m2)；(5)TC(累计环磷酰胺2 000～3 000 mg/m2、多西他赛300～450 mg/m2)。见表1。所有患者随访至化疗结束后至少6个月。

表1 绝经前乳腺癌患者临床特征

2.2 卵巢储备功能

2.2.1 AMH 化疗前基线AMH水平与年龄呈负相关，见表2。经过1周期化疗AMH明显下降(P=0.000)，并随化疗的进行持续降低；至化疗结束时基本低于检测下限；化疗结束6个月后，AMH水平虽然有所回升，但与化疗结束时无明显差异(P=0.862)，仍明显低于化疗前(P=0.000)，见表3。化疗结束6个月时，AMH水平与入组年龄及基线E2均呈负相关(P=0.000，P=0.002)，而与基线AMH呈正相关 (P=0.007),见表4。基线AMH较高的患者，其化疗1周期后(Rs=0.669，P=0.000)及化疗结束时的AMH水平仍较高(Rs=0.351，P=0.026)。

2.2.2 E2化疗前基线E2水平与入组年龄呈正相关，见表2，化疗1周期后较基线升高，但差异无统计学意义(P=0.829)；至化疗结束后，E2明显降低(P=0.000)，处于绝经后范围内(<90 pmol/L)；化疗结束6个月时，E2与化疗后无明显差异(P=0.109)，见表3。患者入组年龄越小(P=0.020)，基线AMH越高(P=0.015)，化疗结束6个月时E2水平相对更高，见表4。

表2 化疗前卵巢储备功能相关因素

表3化疗前后及随访期卵巢储备功能变化

项目化疗前(n=40)化疗1周期(n=40)化疗结束时(n=40)化疗结束6个月(n=40)距化疗开始时间-2～3周2～5月8～12月AMH (ng/mL)2.38±0.721.10±0.44∗0.08±0.01∗0.51±0.27∗E2 (pmol/L)408.67±50.13502.70±90.5153.55±7.02∗163.65±52.08∗FSH (IU/L)7.25±1.8016.33±3.0757.03±3.75∗32.97±2.70∗ △

*与化疗前比较P<0.01; △与化疗结束时比较P<0.01

2.2.3 FSH 单次化疗对患者FSH的影响与基线相比差异无统计学意义(P=0.119)，但此时FSH平均值已>10 IU/L，至6～8周期化疗结束时，FSH明显高于基线水平(P=0.000)，且FSH达到绝经后范围(>22 IU/L)；化疗结束6个月后FSH与化疗结束时相比明显回落(P=0.001)，但仍基本位于绝经后范围内，见表3。未发现化疗结束6个月时FSH的相关因素，见表4。

2.3 CIA及月经恢复 共有38例患者出现CIA，占95%，随访至化疗结束6个月时，即距开始化疗8～12个月，此时CIA患者中有13.2%(5/38)恢复规律月经，因此月经规律的患者共占17.5%(7/40)。出现CIA主要和入组年龄较大(P=0.045)和化疗前AMH水平较低相关(P=0.023)，而入组年龄较小(P=0.008)及化疗前AMH水平较高(P=0.003)的患者更容易恢复规律月经，见表5。本研究未发现化疗方案与CIA及月经恢复有明显相关性。

表4 化疗结束6个月后卵巢功能相关因素

表5 CIA及月经恢复相关因素

3 讨论

本研究是一项单中心前瞻性研究，主要探讨包含环磷酰胺的化疗方案对绝经前乳腺癌患者卵巢储备功能的影响及其相关因素，探讨CIA及化疗后残存卵巢储备功能的预测指标。

卵巢储备功能由原始卵泡决定，而原始卵泡数自出生后不再增加，至青春期后的每个月经周期里，原始卵泡以大致固定比例被招募，并开始生长发育，通常只有一个卵泡发育成熟并排卵，其余招募卵泡闭锁。因此，随着女性年龄的增加，原始卵泡进行性减少，卵巢储备功能逐年降低。当年龄超过35～37岁预示卵巢储备下降，超过40岁是公认的卵巢低反应高危因素[7]。原始卵泡数目前尚无法直接测量。不过，一旦原始卵泡被招募就开始分泌AMH，当卵泡增长超过8 mm进入FSH依赖生长阶段时AMH停止分泌，因此AMH可间接反映原始卵泡数，绝经后AMH不能测及[8]。较低的AMH阈值对判断卵巢储备功能不良有良好的敏感性和特异性，此外，AMH还参与调节原始卵泡招募，降低原始卵泡对FSH的敏感性，避免原始卵泡过度损耗[9]。对年龄20～40岁女性，目前认为AMH位于1.0～3.0 ng/mL为卵巢储备功能正常水平，0.7～0.9 ng/mL为偏低，0.3～0.6 ng/mL为降低，<0.3 ng/mL极低[8]。

E2主要由生长期卵泡分泌，随着卵泡的生长，E2逐渐升高。而当卵巢内储备的卵泡减少，不能产生足够的抑制素来抑制FSH时，更多的FSH可促使原始卵泡提前进入募集和生长阶段，导致后一月经周期的卵泡早期已存在提前发育的卵泡，并产生较高水平的E2。因此，基础E2升高提示卵巢储备功能降低，而且其升高早于基础FSH的升高[7,9]。

FSH由垂体前叶分泌，能刺激生长期卵泡颗粒细胞增生分化，并刺激卵泡产生雌激素[8]。基础FSH水平可间接反映卵泡池的大小，FSH超过10 IU/L对判断卵巢储备功能降低有很高的特异性，但敏感性不高[7]。FSH正常而基础E2升高，是介于卵巢储备功能明显降低和正常之间的过渡阶段。如果基础FSH和E2水平均升高，则提示卵巢储备降低。基础血清E2在184～367 pmol/L范围内预测卵巢低反应，但应与FSH结合判断[7]。

本研究中化疗前基线AMH为(2.38±0.72)ng/mL， FSH均值未超过10 IU/L，提示入组患者卵巢储备功能位于正常范围内，其中年龄较大者AMH偏低而E2偏高。经过1周期化疗，AMH明显下降，E2浓度较基线有升高的趋势，FSH平均值>10 IU/L，说明含有环磷酰胺的方案仅单次给予就可损伤卵巢储备功能。有研究报道经过1周期化疗AMH急剧降低，基线AMH较高的患者1周期化疗后AMH水平仍相对较高[10-11]，与本研究结果类似。本研究中化疗结束时大多数患者的AMH已降至检测下限以下，且E2及FSH均降低至绝经后水平，至化疗停止6个月后，AMH、E2与化疗结束时水平无明显差异，FSH均值仍处于绝经后范围内，均未能恢复化疗前水平，这些与相关研究结果类似[12-13]。Yu等[12]的研究报道，化疗后12个月E2和FSH可恢复基线水平，而Wenners等[13]的研究结果与之相反，但两个研究中患者的AMH均维持在极低水平。

单从血清学并不能直接反映原始卵泡的情况，一项人卵巢异种移植模型研究发现，注射环磷酰胺48 h后就可出现原始卵泡丢失高峰，而早在注射后12 h，就出现以TUNEL标记的原始卵泡凋亡高峰[14]。卵母细胞凋亡是化疗致原始卵泡丢失的主要原因，化疗药物可导致卵母细胞DNA发生多种损伤，其中DNA双链断裂危害最大[14-15]。卵母细胞在损伤初始可启动DNA损伤修复通路，但大多数修复失败，随后凋亡程序启动，损伤卵母细胞被清除。烷化剂和拓扑异构酶抑制剂均能导致原始卵泡DNA双链损伤[15-16]。此外，处于有丝分裂期的生长期卵泡，对任何化疗药物都很敏感，包括对原始卵泡来说低毒的药物[15]。另一方面，生长期卵泡受到损害后，其对原始卵泡招募的抑制作用减弱，原始卵泡招募增多继而过度活化[17]，加速原始卵泡消耗。此外，化疗药物还可造成卵巢血管并发症，如阿霉素可导致卵巢血管痉挛，血流量急剧减少，新生及成熟血管密度降低[15,18]。不但原始卵泡依赖充足的血管生成，生长期卵泡同样如此，并且对急性缺血更加敏感，卵巢血管密度和原始卵泡凋亡之间呈负相关[19]。最终，多次化疗致使原始卵泡加速耗竭。

通常化疗药物按其导致不孕风险的高低分为以下几类[20-21]:(1)高风险药物:烷化剂，包括环磷酰胺、氮芥、苯丁酸氮芥、白消安和美法仑等;(2)中等风险药物:蒽环类抗生素中的阿霉素及表阿霉素;铂类药物，如顺铂、卡铂;(3)低风险药物:紫杉类，如紫杉醇、多西紫杉醇;抗代谢药，如甲氨喋呤、5-氟尿嘧啶、阿糖胞苷;其他蒽环类药物，如博来霉素、柔红霉素;长春花碱类，如长春新碱。本研究并未发现化疗方案(EC-D/P、TEC、TC)与月经改变及化疗后卵巢功能有关。Wenners等[13]的研究结果也未发现FEC、TAC、EC/P、FEC/T、CMF方案与化疗后AMH及月经状态存在相关性。Dezellus等[11]的研究也发现环磷酰胺累积量(是否超过1 500 mg/m2)与化疗后AMH水平无关。可能的原因为上述化疗方案均包含环磷酰胺，且绝大部分方案为环磷酰胺与阿霉素/表阿霉素联合化疗，提示乳腺癌的化疗方案中是否包含致不孕的中高风险药物，特别是高风险药物，可能成为化疗后卵巢功能损伤的决定因素。

本研究中有95%患者出现CIA，化疗结束后6个月有78.5%的患者未恢复月经，与相关报道类似[11,13]。本研究还发现，出现CIA的患者年龄较大而基线AMH较低，月经恢复和化疗后6个月AMH除了与年龄小、基线AMH高有关外，还与较低的基线E2水平相关。Wenners等[13]的研究也发现闭经与基线AMH水平相关，化疗后卵巢储备功能与年龄呈负相关，与基线AMH呈正相关。由于化疗后部分女性虽能保持多年规律月经却因卵巢储备功能显著降低而不孕[5]。因此，除年龄因素外[22]，在卵巢衰竭前使用生化指标评估生育期乳腺癌女性卵巢储备功能方面具有重要的临床意义，除了可发现化疗方案对卵巢的损伤并长期评估卵巢功能以外，更有利于早期识别卵巢储备功能降低的育龄期乳腺癌患者。结合本研究发现，对有生育需求的乳腺癌女性，特别是年龄偏大及化疗前AMH较低、E2较高者，应于化疗前使她们及时获得生育咨询，提供如胚胎冻存、卵子冻存、卵巢组织冻存等女性生育功能保留的相关信息。

本研究的前瞻性设计有效避免了对月经状态判断的回忆性偏倚。而因肿瘤治疗的时限要求，随机E2、FSH检测对结果解释可能有一定影响，此外随访至化疗结束后6个月可能低估月经恢复情况。随着样本量的扩大及随访期延长至化疗结束后至少1年，可进一步判断年龄、AMH及E2对CIA或绝经的最佳预测截断值，还可对40岁前后患者做亚组分析，将为绝经前早期乳腺癌患者生育/卵巢功能保护及内分泌治疗方案选择提供依据。